復(fù)合防腐劑對(duì)腌制蔬菜中腐敗細(xì)菌的抑制效果研究

姜紹通，孫 磊，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品分離工程研究所，安徽 合肥 230009)

復(fù)合防腐劑對(duì)腌制蔬菜中腐敗細(xì)菌的抑制效果研究

姜紹通，孫 磊，羅水忠，潘麗軍

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品分離工程研究所，安徽 合肥 230009)

對(duì)腌制蔬菜中的腐敗菌進(jìn)行分離與鑒定，結(jié)果表明：腌制蔬菜中腐敗菌主要為6株細(xì)菌，其中4株球菌，1株鏈桿菌，1株桿菌，都為革蘭氏陽(yáng)性菌。對(duì)腐敗菌的抑菌劑進(jìn)行篩選與優(yōu)化，結(jié)果表明：Nisin、脫氫醋酸鈉、尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)腐敗菌有明顯的抑制作用。正交試驗(yàn)優(yōu)化得到復(fù)合防腐劑最佳配方為：Nisin 0.4g/L、脫氫醋酸鈉0.3g/L、尼泊金復(fù)合酯鈉0.2g/L。在該復(fù)配條件下對(duì)于實(shí)驗(yàn)中分離得到的6種腐敗菌及食品中常見的腐敗菌(金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)都有良好的抑制效果，抑制率都在96%以上。

腌制蔬菜；復(fù)合防腐劑；抑菌

我國(guó)腌制菜起源于周朝，距今約有3000年歷史[1]，是我國(guó)傳統(tǒng)佐餐食品，袋裝產(chǎn)品是其市場(chǎng)銷售的主要形式。為保證貨架期，生產(chǎn)過程通常采用高溫滅菌結(jié)合添加苯甲酸鹽等防腐劑進(jìn)行。其過程往往導(dǎo)致腌制蔬菜脆度下降、色澤變暗，且風(fēng)味變差。所以研究非熱殺菌和高效安全的腌制菜防腐劑備受人們關(guān)注。王敏等[2]在研究中發(fā)現(xiàn)高鹽醬腌菜坯致腐微生物主要為堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。陳建初等[3]在研究中發(fā)現(xiàn)雖然熱力殺菌對(duì)袋裝榨菜有一定的防腐效果，但是添加一定的防腐劑是必要的。

新型高效的防腐劑的開發(fā)現(xiàn)今尤為重要，其中一些具有安全并且有廣泛應(yīng)用前景的防腐劑也廣受人們的關(guān)注。Nisin作為一種新型的生物防腐劑具有安全、無(wú)毒的特性，但是抑菌譜較窄，其能抑制大部分G+菌及其芽孢的生長(zhǎng)和繁殖，但對(duì)G－菌抑制效果不明顯[4]。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，具有高效抑菌能力，良好的成膜性，并且天然、無(wú)毒、無(wú)害，在食品的防腐保鮮方面有著較高的應(yīng)用價(jià)值[5]。脫氫醋酸鈉、尼泊金復(fù)合酯是高效、廣譜、安全的防腐劑，其對(duì)真菌、細(xì)菌都有一定的抑制效果[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)即通過對(duì)上述各種防腐劑成分及質(zhì)量濃度的復(fù)合研究，旨在得到一種高效的復(fù)合防腐劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腌制蔬菜 安徽露仙調(diào)味食品有限公司；Nisin 浙江銀象生物工程有限公司；尼泊金復(fù)合酯鈉、脫氫醋酸鈉 廣州市安心生物制品有限公司；殼聚糖 青島海普生物技術(shù)有限公司；富馬酸鈉 鄭州瑞普生物工程有限公司。

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室；腐敗菌從腐敗的腌制蔬菜中分離。

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，加入20g/L瓊脂為固體培養(yǎng)基(用于菌種分離)。

1.2 儀器與設(shè)備

SWCJCO雙面無(wú)菌操作臺(tái) 江蘇凈化設(shè)備有限公司；UV-1201紫外-可見光分光光度計(jì) 北京瑞利分析儀器公司；250D數(shù)顯光照培養(yǎng)箱 江蘇金壇市正基儀器有限公司。

1.3 菌種的分離純化與鑒定

菌種的分離方法參考文獻(xiàn)[8]進(jìn)行。菌種的初步鑒定參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。

1.4 單一防腐劑對(duì)腌制蔬菜中腐敗菌抑制作用研究

將Nisin、脫氫醋酸鈉、尼泊金復(fù)合酯鈉(尼泊金乙酯鈉:尼泊金丙酯鈉=1:1)、脫氫醋酸鈉、殼聚糖按照國(guó)標(biāo)最大添加量稀釋成不同的質(zhì)量濃度，添加到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，分別接種對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的腐敗菌1mL，培養(yǎng)12h，測(cè)定腐敗菌的生長(zhǎng)情況。

1.5 復(fù)配防腐劑對(duì)腌制蔬菜中腐敗菌的抑制作用研究

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)于致腐菌有一定抑制作用的防腐劑質(zhì)量濃度進(jìn)行復(fù)合，進(jìn)行正交試驗(yàn)。正交試驗(yàn)選用正交表L9(34)。因素及水平如表1所示。

表1 復(fù)合防腐劑優(yōu)化的正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test for optimizing compound preservative

1.6 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

將優(yōu)化后的復(fù)合防腐劑配方，按照實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量濃度加入腌制蔬菜中，包裝，85℃殺菌。以不加入防腐劑的腌制蔬菜為對(duì)照，將其置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2d測(cè)定其細(xì)菌總數(shù)，細(xì)菌總數(shù)測(cè)定：按照GB4789.2—1994《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行。具體實(shí)驗(yàn)步驟按照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.7 分析方法

腐敗菌生長(zhǎng)的測(cè)定：比濁法，測(cè)定OD600nm值。用腐敗菌的抑制率評(píng)價(jià)防腐劑的抑制效果。腐敗菌的菌落數(shù)用標(biāo)準(zhǔn)曲線法[11]計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌制蔬菜中腐敗菌的分離與初步鑒定

取腐敗的腌制蔬菜25g，無(wú)菌剪碎，于225g無(wú)菌水中用力振蕩攪拌。稀釋成不同倍數(shù)的溶液，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)24h后計(jì)數(shù)。其中腐敗菌分離和初步鑒定結(jié)果如表2所示。

表2 腌制蔬菜中腐敗菌的分離及初步鑒定結(jié)果Table 2 Separation and preliminary identification of spoilage bacteria in pickled vegetables

2.2 單一防腐劑對(duì)腌制蔬菜中腐敗菌的抑制效果

2.2.1 Nisin對(duì)于腐敗菌的抑制效果

圖1 不同質(zhì)量濃度Nisin對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.1 Suppression effect of Nisin at various concentrations on spoilage bacteria

由圖1可知，Nisin對(duì)1號(hào)、5號(hào)、6號(hào)菌有很好的抑制效果，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到0.15g/L時(shí)，對(duì)這3種致腐菌的抑制率分別達(dá)到了70.59%、69.88%、91.83%，但是對(duì)于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，當(dāng)Nisin質(zhì)量濃度達(dá)到最大即0.5g/L時(shí)，其抑制率分別達(dá)到95.86%、86.20%。

2.2.2 脫氫醋酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果

由圖2可知，脫氫醋酸鈉對(duì)所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的5種腐敗菌都有較好的效果，其中對(duì)于1號(hào)菌和6號(hào)菌，在脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度為0.2g/L時(shí)，抑制率就分別達(dá)到了95.57%和66.19%，對(duì)于5號(hào)菌，金黃色葡萄球菌，枯草芽孢桿菌，隨著脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度的增大，抑菌效果迅速增強(qiáng)。當(dāng)防腐劑質(zhì)量濃度達(dá)到0.4g/L時(shí)，可以較強(qiáng)的抑制除金黃色葡萄球菌外的腐敗菌。

圖2 不同質(zhì)量濃度脫氫醋酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.2 Suppression effect of sodium dehydroacetate at various concentrations on spoilage bacteria

2.2.3 富馬酸鈉對(duì)于腐敗菌的抑制效果

圖3 不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.3 Suppression effect of sodium fumarate at various concentrations on spoilage bacteria

由圖3可知，隨著富馬酸鈉質(zhì)量濃度的增大，對(duì)腐敗菌的抑制效果逐漸增強(qiáng)，對(duì)1號(hào)及5號(hào)腐敗菌的抑制效果較好，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.3g/L及以上時(shí)，基本可以完全抑制這兩種菌。但是對(duì)于6號(hào)菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌，當(dāng)其質(zhì)量濃度達(dá)到最大，即質(zhì)量濃度達(dá)到0.4g/L時(shí)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制率僅有31.14%，對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制率也僅有26.14%。

2.2.4 殼聚糖對(duì)于腐敗菌的抑制效果

圖4 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.4 Suppression effect of chitosan at various concentrations on spoilage bacteria

殼聚糖對(duì)腐敗菌的抑制效果如圖4所示，殼聚糖由于其絮凝作用，在添加到液體培養(yǎng)基時(shí)，抑制效果比較明顯，但是從實(shí)驗(yàn)過程可以看出，由于其會(huì)使液體培養(yǎng)基中菌體沉降，用于實(shí)際生產(chǎn)時(shí)，會(huì)影響產(chǎn)品的風(fēng)味，所以沒有考慮將殼聚糖作為復(fù)合防腐劑的成分。

2.2.5 尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)于腐敗菌的抑制效果

圖5 不同質(zhì)量濃度尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果Fig.5 Suppression effect of Nipagin composite sulfate at various concentrations on spoilage bacteria

尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)腐敗菌的抑制效果如圖5所示，其對(duì)于1號(hào)菌有比較好的抑制效果，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.2g/L時(shí)，抑制率達(dá)到了89.63%，對(duì)于6號(hào)菌，金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌，在尼泊金復(fù)合酯鈉最大質(zhì)量濃度下才對(duì)其有明顯的抑制效果，抑制率分別達(dá)到了61.10%、51.13%、57.62%。

綜上所述，脫氫醋酸鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)的5種致腐菌均有良好的抑制作用，Nisin 對(duì)于1號(hào)、5號(hào)、6號(hào)菌具有良好的抑制效果，對(duì)于金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌隨著添加質(zhì)量濃度的提高，抑制效果增強(qiáng)比較明顯，尼泊金復(fù)合酯鈉對(duì)于所篩得的致腐菌有一定的抑制作用，但其與其他防腐劑復(fù)合會(huì)有較好的抑菌效果。

所以選擇脫氫醋酸鈉、Nisin、尼泊金復(fù)合酯鈉作為下一步復(fù)合防腐劑的成分。

2.3 復(fù)合防腐劑最佳配方對(duì)于抗性較強(qiáng)菌種的正交試驗(yàn)結(jié)果

由實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，6號(hào)菌，金黃色葡萄球菌是對(duì)于防腐劑抗性較強(qiáng)的菌種，所以以下選用這兩種菌的抑制率作為正交試驗(yàn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。并且對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、4。

通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及方差分析結(jié)果，可以得出各因素對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果的顯著水平：Nisin質(zhì)量濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果影響極為顯著，脫氫醋酸鈉及尼泊金復(fù)合酯鈉質(zhì)量濃度對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果不顯著。因素主次順序?yàn)锳CB，直觀分析和計(jì)算最佳水平組合均為A3C2B2即添加復(fù)合防腐劑Nisin質(zhì)量濃度0.4g/L，脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度0.25g/L，尼泊金復(fù)合酯質(zhì)量濃度0.2g/L時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果最好，抑制率達(dá)到了99.83%。同時(shí)可以得出因素對(duì)6號(hào)菌的抑制效果的顯著水平，Nisin質(zhì)量濃度高度顯著，脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度影響顯著，尼泊金復(fù)合酯鈉質(zhì)量濃度影響不顯著。因素主次順序?yàn)锳BC，計(jì)算分析最佳水平組合為A3B3C2。即Nisin質(zhì)量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度為0.3g/L，尼泊金復(fù)合酯鈉質(zhì)量濃度為0.2g/L，此時(shí)，6號(hào)菌抑制率可以達(dá)到99.94%。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experimental results

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果極差分析Table 3 Range analysis of orthogonal experimental results

綜合上述分析，根據(jù)因素相對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)菌種的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著性不同，考慮成本、效果，復(fù)合防腐劑配方應(yīng)為A3B3C2。即Nisin質(zhì)量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度為0.3g/L，尼泊金復(fù)合酯鈉質(zhì)量濃度為0.2g/L。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將優(yōu)化后得到的復(fù)合防腐劑添加到腐敗菌中，得到其對(duì)1號(hào)菌抑制抑制率達(dá)到99.57%，2號(hào)菌抑制率得到99.22%，3號(hào)菌抑制率達(dá)到99.87%，4號(hào)菌達(dá)到98.79%，5號(hào)菌達(dá)到99.84%，6號(hào)菌達(dá)到99.79%，金黃色葡萄球菌抑制率達(dá)到98.42%，枯草芽孢桿菌抑制率達(dá)到96.09%。

2.5 應(yīng)用實(shí)驗(yàn)

按照復(fù)合防腐劑配方，將防腐劑加入到調(diào)配腌制蔬菜的料液中，調(diào)配，包裝后于85℃下殺菌15min，于恒溫培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)16d，每2d測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。其結(jié)果如圖6所示。

圖6 復(fù)合防腐劑處理前后腌制蔬菜中細(xì)菌總數(shù)變化趨勢(shì)Fig.6 Change trends of total bacterial number in pickled vegetables treated by compound preservatives

由圖6可以看出，空白組在儲(chǔ)藏期間第8天～第10天，其細(xì)菌總數(shù)大于3×103CFU/g，已經(jīng)腐敗。但是當(dāng)添加復(fù)合防腐劑時(shí)，腌制蔬菜的細(xì)菌總數(shù)在實(shí)驗(yàn)的16d內(nèi)，一直處于140CFU/g以下。對(duì)比空白組，有很高的保鮮程度，說明復(fù)合防腐劑對(duì)于腌制蔬菜有很好的保鮮效果。

3 結(jié) 論

3.1 在腐敗的腌制蔬菜中，其致腐菌有6種細(xì)菌，其中有4種球菌、1種鏈桿菌、1種桿菌。經(jīng)革蘭氏染色后全為陽(yáng)性。

3.2 經(jīng)過單因素及正交試驗(yàn)結(jié)果分析，得出在復(fù)合防腐劑(Nisin質(zhì)量濃度為0.4g/L，脫氫醋酸鈉質(zhì)量濃度為0.3g/L，尼泊金復(fù)合酯鈉質(zhì)量濃度為0.2g/L)作用下，對(duì)于所進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的食品中致腐菌的抑制率都達(dá)到了96%以上。

3.3 將所篩選的復(fù)合防腐劑添加到腌制蔬菜中，在37℃下培養(yǎng)16d，其仍然具有較好的保鮮程度，可以起到延長(zhǎng)貨架期的目的。

[1] 周濤. 蔬菜腌制品的種類及腌制原理和保藏措施[J]. 中國(guó)調(diào)味品,2000, 255(5): 6-12.

[2] 王敏, 張耀相, 肖翔. 高鹽醬腌菜坯致腐微生物的分離鑒定[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2003(5): 19-20.

[3] 陳健初, 葉興乾, 吳丹. 真空軟包裝榨菜和蘿卜熱力殺菌工藝研究[J]. 食品工業(yè), 2008(6): 11-13.

[4] REUNANEN J, SAIRS P E J. Bioassay for nisin in sausage; a shelf life study of nisin in cooked sausage[J]. Meat Science, 2004, 66(3): 515-518.

[5] 王鴻, 沈月新. 不同脫乙酰度殼聚糖的抑菌性[J]. 上海水產(chǎn)大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 10(4): 380-382.

[6] 黎婉園, 姚朔影, 夏楓耿. 脫氫醋酸鈉及其抗菌性試驗(yàn)[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2004(2): 41-44.

[7] 李永飛, 沈良, 齊艷. 尼泊金復(fù)合酯在醬菜生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].中國(guó)釀造, 2004, 133(4): 19-20.

[8] 潘麗軍, 劉蘭花, 曾敏. Nisin和植酸復(fù)合抑制腌制蔬菜中G－腐敗菌的效果研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2008(2): 263-268.

[9] 錢存柔, 黃儀秀. 微生物實(shí)驗(yàn)教程[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 2003.

[10] 易建華, 朱振寶. 不同工藝條件對(duì)醬腌菜保藏品質(zhì)的影響[J]. 食品科技, 2008(9): 43-47.

[11] 王向陽(yáng), 周蓉, 劉繪景. 真空包裝腌制蘿卜干中致病菌的抑制[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2008, 355(9): 56-60.

Suppression Effect of Compound Preservative on Spoilage Bacteria in Pickled Vegetables

JIANG Shao-tong，SUN Lei，LUO Shui-zhong，PAN Li-jun
(Institute of Agricultural Products Separation Engineering, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Separation and identification of spoilage bacteria from pickled vegetables indicated that there were six dominant Grampositive bacteria including four strains of coccus, one strain of streptobacillus and one strain of bacillus. Meanwhile, the screening and optimization of bacteriostatic agents on spoilage bacteria were conducted. An obvious suppression effect of Nisin,sodium dehydroacetate or sodium Nipagin on spoilage bacteria was observed. Moreover, a compound preservative was optimized to be 0.4 g/L Nisin, 0.3 g/L sodium dehydroacetate and 0.2 g/L sodium Nipagin ester through orthogonal test. This compound preservative exhibited an excellent suppression effect on six strains of bacteria separated from pickled vegetables and common spoilage bacteria such as Staphylococcus aureus and Bacillus subtilis in food. The suppression rate could reach up to 96%.

pickled vegetable；compound preservative；bacteriostasis

TS255.36

A

1002-6630(2010)09-0054-05

2009-09-02

安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究基金項(xiàng)目(08152317)

姜紹通(1954—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品生物化工。E-mail：jiangshaotong@yahoo.com.cn