李樹平 馮曉源 梁春敏 何慧瑾 孟慶剛 占昌友李 瑾顧 炳佘振玨邱龍華楊 波陳路平

二十多年前,已經(jīng)有很多學(xué)者以白蛋白作為載體共價(jià)連接DTPA再與釓螯合合成一種大分子造影劑,但這些研究多集中在其作為血池性造影劑及評價(jià)血管生成的性能上[1-6];白蛋白作為一種可以被多功能修飾的前體造影劑的特性尚未被充分開發(fā)[7]。隨著分子影像學(xué)的飛速發(fā)展,磁共振的高空間分辨率給阿爾茨海默病的顯示帶來了希望[8],同時(shí)也給磁共振的靈敏度帶來了挑戰(zhàn)。提高磁共振成像靈敏度給磁共振造影劑性能提出了更高的要求,同時(shí)制備出可以進(jìn)行多功能修飾的磁共振造影劑前體也是分子影像學(xué)發(fā)展的需要[9]。本文改進(jìn)了BSA-(Gd-DTPA)n的制備及純化方法,制備出既具備高弛豫特性又還存有多個(gè)可被修飾氨基的前體造影劑,并對其體內(nèi)及體外特性進(jìn)行初步表征。

方 法

1.儀器與試劑

1.1儀器:EXCITEⅡ1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀(美國GE公司);NM I20-Analyst/PQ 001(上海紐邁電子科技有限公司)。AKTA exp lorer 100中壓層析系統(tǒng)(瑞典安發(fā)瑪西亞公司);P-4010電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀。ALPHA 1-2凍干機(jī)。顯微鏡、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、脫色搖床、電磁恒溫磁力攪拌器等。

1.2試劑:牛血清白蛋白 (BSA,電泳純98%,SIGM A);二乙烯三胺五乙酸環(huán)酐(DTPACA,分析純,SIGMA);GdCl3.6H 2O(分析純,SIGMA);Sephadex G-15葡聚糖凝膠(瑞典AB公司)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.實(shí)驗(yàn)動物

磁共振成像實(shí)驗(yàn)選取60日齡SPF級SD大鼠2只,體重約250g。急性毒性實(shí)驗(yàn)所用小鼠為昆明小白鼠,約 18～ 20g,共18只。

3.BSA-(Gd-DTPA)n及Gd-DTPA的制備、鑒定及表征

3.1BSA-(Gd-DTPA)n及Gd-DTPA的制備及純化:根據(jù)文獻(xiàn)方法[2]并加以改進(jìn),稱取50mg的BSA,加入1ml的0.05m ol/L,pH=9的磷酸緩沖液(PBS),56mg的DTPACA直接加入BSA溶液中,用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值,使pH值保持在6～7,25℃攪拌1h后,再加入與DTPACA等物質(zhì)量的GdCl3溶液(用少量1mol/L的鹽酸溶液溶解),繼續(xù)攪拌1h。反應(yīng)液用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH值至pH=7.4,使未反應(yīng)的游離Gd3+沉淀,離心后除去沉淀,上清用Sephadex G-15凝膠柱進(jìn)行分離,用pH=7.4的PBS作為流動相進(jìn)行洗脫,在280nm處紫外監(jiān)測洗脫過程,收集第一個(gè)峰的洗脫液,即為BSA-(Gd-DTPA)n偶聯(lián)物的PBS溶液,凍干后再以純水作為流動相進(jìn)行脫鹽分離即得純化的BSA-(Gd-DTPA)n偶聯(lián)物。

3.2BSA與Gd-DTPA偶聯(lián)率的測定:采用高頻電感等離子體發(fā)射光譜法 (ICP-AES)測量樣品中Gd3+的含量,并計(jì)算Gd-DTPA對蛋白質(zhì)的偶聯(lián)率。

3.3BSA-(Gd-DTPA)n與BSA的電泳圖:采用SDS-PAGE鑒定BSA-(Gd-DTPA)n的分子量范圍,方法如下[10]:依次配制含聚丙烯酸胺7%的分離膠和5%的濃縮膠,樣品干粉溶于PBS,待濃縮膠干后上樣BSA、BSA(Gd-DTPA)n和marker各 10μg,分離膠電泳以25mA恒流,濃縮膠電泳以45mA恒流,電泳完立即置于固定液 (500ml乙醇,100ml冰醋酸,400ml蒸餾水)中50m in,考馬斯亮藍(lán)染色10min(0.29g考馬斯亮藍(lán)溶解在250ml脫色液中,在使用前邊攪拌邊加熱至60℃,多次變換脫色液(250ml乙醇,80ml冰醋酸,加蒸餾水至1L),直至凝膠背景脫凈為止。

4.BSA-(Gd-DTPA)n的弛豫性能

4.1BSA-(Gd-DTPA)n溶液的磁共振成像:取一定量BSA-(Gd-DTPA)n配成濃度為0.1mmo l/L的水溶液2ml,再分別稀釋10倍、100倍、1000倍,裝入2mlEP管中,對照為0.5m ol/L商品造影劑釓噴酸葡胺溶液稀釋500倍(即濃度為1mmol/L),再分別稀釋 10倍、100倍、1000倍、10000倍,裝入 2mlEP管中行磁共振T 1W和T 2W成像,成像參數(shù)略。

4.2體外弛豫時(shí)間T 1的測定及R1的計(jì)算:準(zhǔn)確稱取一定量BSA-(Gd-DTPA)n溶于1.5ml體積分?jǐn)?shù)為20%的重水中,配制成5mmol/L的溶液。用微量移液器取0.5ml置于15mm核磁樣品管中,于0.5T NM I20-Analyst和PQ 001核磁共振儀(配置15mm直徑探頭線圈,32℃)上采用反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測其縱向弛豫時(shí)間T1,采樣方式采用腳本采樣;采用CPMG序列測量其橫向弛豫 T 2,根據(jù)公式計(jì)算其 R1及R2值。用同樣方法測定配合物在0.725mmol/L牛血清白蛋白(BSA)溶液中的弛豫時(shí)間T 1、T 2及R1、R 2值。

5.小鼠急性毒性試驗(yàn)

配合物BSA-(Gd-DTPA)n以滅菌注射用水配制成水溶液,溶液pH值調(diào)至7～8,以0.45μm微孔濾膜濾除不溶機(jī)械雜質(zhì),注人數(shù)只安瓶瓶中分裝,熔融封管,然后于39.23×104Pa,120°C下消毒 30m in,溶液均澄清透明,表明其熱穩(wěn)定性良好。無菌條件下取昆明種小白鼠,從小白鼠尾靜脈一次注射不同劑量(0.05ml,0.10ml,0.15ml,0.20ml,0.25ml)的樣品后于當(dāng)時(shí)和周后觀察其急性毒性,每個(gè)劑量均平行試驗(yàn)3次。0.25ml劑量組及對照組3只小鼠,處死解剖后取肝、腎組織行H-E染色。

6.BSA-(Gd-DTPA)26大鼠磁共振增強(qiáng)掃描

EXCITE Ⅱ1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀 (美國GE公司),人腕關(guān)節(jié)線圈。FSPGR/T 1W I序列,TR 170m s,TE1.5ms。FOV=60mm,層厚/層間距=3.0/0.5mm,數(shù)據(jù)采集矩陣為128×128。實(shí)驗(yàn)選用10%水合氯醛,作為大鼠的麻醉劑,腹腔注射,劑量為350～400mg/kg。造影劑的釓濃度為5mmol/L,每只大鼠約注射 1ml。

結(jié) 果

1.BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA的鑒定及表征

1.1BSA與Gd-DTPA偶聯(lián)率的測定及BSA-(Gd-DTPA)26紫外掃描圖:通過ICP-AES測得配合物中Gd的含量為5.1%,通過換算得出BSA與Gd-DTPA平均偶聯(lián)率n=26,而白蛋白上總共有59個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基,據(jù)此可以推算平均每個(gè)白蛋白上尚殘留23個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基,這些氨基可進(jìn)一步進(jìn)行修飾,比如連接靶向頭基/熒光探針或者進(jìn)行陽離子化等等。分離過程中獲得的BSA-(Gd-DTPA)26在Sephadex G-15葡聚糖凝膠柱上的凝膠色譜圖見圖1。

圖1 凝膠過濾色譜法純化BSA-(Gd-DTPA)26的色譜圖,第一個(gè)較高的峰為BSA-(Gd-DTPA)26,緊接著后面的小峰為Gd-DTPA。圖2 SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳圖。1為BSA樣品,分子量為67000左右,3為BSA-(Gd-DTPA)n樣品,可見BSA-(Gd-DTPA)n有兩條條帶,提示分子量介于70000～118000之間,是不同n值的混合物。

1.2 BSA-(Gd-DTPA)n及BSA電泳圖:SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳顯示BSA-(Gd-DTPA)n的分子量,如圖2。樣品分子量為67000左右,BSA-(Gd-DTPA)n有兩條條帶,提示分子量介于70000～118000之間,是不同n值的混合物,26是不同n值的平均值。其余較淡條帶為少量雜質(zhì)。

2.BSA-(Gd-DTPA)26的弛豫性能

2.1 BSA-(Gd-DTPA)26溶液的磁共振成像:見圖 3。

2.2 T1反演擬合曲線及R1的擬合曲線圖:BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA T 1按照單組分反演擬合結(jié)果如圖4,T2的反演及擬合曲線略。通過測得樣品的T 1、T 2值,我們可以計(jì)算得到樣品溶液的弛豫率,計(jì)算公式如下[11]:

公式(1)中,R為弛豫率,i(i=1,2)為樣品的弛豫時(shí)間類型,Ti為樣品的弛豫時(shí)間。另外,如果要計(jì)算溶液中溶質(zhì)的濃度,我們需要知道溶液的濃度,單位為m ol/L,計(jì)算公式如下:

圖3 BSA-(Gd-DTPA)26溶液及對照的 T 1WI(A)和 T 2WI(B)成像。 1、4、5列分別為釓雙胺注射液,BSA-(Gd-DTPA)26水溶液、釓噴酸葡胺、BSA水溶液,濃度從上到下依次為 1、0.1、0.01、0.001、 0.0001、 0.00001mm ol/L;3為BSA-(Gd-DTPA)26水溶液,濃度從上到下 依次為 0.1、 0.01、 0.001、0.0001mm ol/L;2列為雙蒸水陰性對照。

其中,To為不同濃度溶液的弛豫時(shí)間,Tw為純水的弛豫時(shí)間,C為對應(yīng)于弛豫率的樣品濃度,ri為溶質(zhì)的弛豫率。由以上理論,根據(jù)已測得的相應(yīng)數(shù)據(jù),可以計(jì)算出樣品及對照的R1、R2、r1、r2等弛豫率。在白蛋白溶液中,我們也近似的按照該公式,計(jì)算出對應(yīng)的R1、R 2、r1、r2等弛豫率。這里測得的純水及白蛋白溶液的 T 1、T 2值分別為 3802.06/2447.08、2294.4/792.48(表 1)。

3.小鼠急性毒性試驗(yàn)

初步的急性毒性實(shí)驗(yàn)顯示,各劑量組小鼠一周后均毛色光澤如初,無任何中毒癥狀,1周內(nèi)無一死亡,其體重與對照組無區(qū)別。解剖后觀察實(shí)驗(yàn)組小鼠的肝、腎均無明確可見的病理改變征象,與生理鹽水對照組無顯著性差異(圖5)。

4.BSA-(Gd-DTPA)n大鼠磁共振增強(qiáng)掃描

圖4 BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA水溶液反演及擬合曲線圖。A為反演曲線,B擬合曲線。圖示BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA T 1值分別為 68.45m s、37.35m s。

表1 BSA-(Gd-DTPA)26及Gd-DTPA在不同溶液中的弛豫時(shí)間及弛豫率

圖5 肝臟H-E染色(×40)。實(shí)驗(yàn)組(A)與對照組(B)未見顯著差異,未見明顯巨噬細(xì)胞增多。

SD大鼠體內(nèi)磁共振成像實(shí)驗(yàn):肝腎平掃T 1W I軸位掃描,尾靜脈注射1ml BSA-(Gd-DTPA)26后分別于1m in、5m in、10m in及30m in后進(jìn)行肝腎多期增強(qiáng)掃描。該實(shí)驗(yàn)初步評價(jià)了BSA-(Gd-DTPA)n對肝臟、腎臟和腹主動脈MRI信號的增強(qiáng)作用,并分析了其隨時(shí)間的變化情況。圖6、圖7為靜脈注射BSA-(Gd-DTPA)26大鼠肝臟和腎臟MRI信號強(qiáng)度隨時(shí)間的變化情況。注射造影劑BSA-(G d-DTPA)26后,1min內(nèi)肝臟和腹主動脈就出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)效果,在整個(gè)成像過程中對肝臟信號增強(qiáng)始終保持升高的趨勢,它對腹主動脈增強(qiáng)模式類似于長循環(huán)血池性造影劑,這是由于白蛋白的長循環(huán)特性決定的。BSA-(Gd-DTPA)n和Gd-DTPA具有非常相似的腎臟代謝模式,但與其又有所不同。注射造影劑后不久,腎臟就出現(xiàn)了明顯的增強(qiáng)效果,一直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束,腎盂內(nèi)仍可見造影劑。可以在多個(gè)時(shí)間窗內(nèi)同時(shí)看到腎盂與腹主動脈的增強(qiáng)。

討 論

本研究成功制備了大分子磁共振造影劑BSA-(Gd-DTPA)n。制備過程中,pH值是影響合成結(jié)果及效率較為重要的因素。BSA與DTPA的偶聯(lián)是在堿性條件下進(jìn)行的,在pH=9的條件下,其偶合效率較高。由于GdCl3在中性或堿性條件下易生成Gd(OH)3沉淀,阻礙釓的螯合,因此后續(xù)螯合釓的實(shí)驗(yàn)應(yīng)在酸性條件下進(jìn)行,本實(shí)驗(yàn)中用5mol/L的NaOH將pH值調(diào)至6～7,且用1mol/L的鹽酸溶液溶解GdCl3,獲得較好的螯合效果。由于DTPACA具有兩個(gè)環(huán)酐,容易使兩個(gè)蛋白質(zhì)交聯(lián)沉淀,從而影響與釓的進(jìn)一步的螯合反應(yīng),因此控制BSA與DTPACA的比例在整個(gè)反應(yīng)過程中也至為關(guān)鍵。太低的比例,偶聯(lián)的DTPA太少影響釓的螯合,從而影響造影劑的弛豫率;太高的比例,白蛋白上的賴氨酸側(cè)鏈氨基反應(yīng)完全,無法進(jìn)行下一步的修飾。本實(shí)驗(yàn)采用控制BSA與DTPACA的比例為1:50,獲得較為合適的偶聯(lián)率。同時(shí),實(shí)驗(yàn)中應(yīng)避免pH值太高或太低,否則白蛋白容易變性。本實(shí)驗(yàn)中BSA與Gd-DTPA平均偶聯(lián)率n=26,而白蛋白上總共有59個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基,據(jù)此可以推算平均每個(gè)白蛋白上尚殘留23個(gè)賴氨酸側(cè)鏈氨基,這些氨基可進(jìn)一步進(jìn)行修飾,比如連接靶向頭基/熒光探針或者進(jìn)行陽離子化等,這樣BSA-(Gd-DTPA)n就可以作為靶向性磁共振造影劑的前體,進(jìn)一步拓寬其應(yīng)用范圍;或者與裝載治療藥物的納米?；蚱渌d體系統(tǒng)連接,成為靶向病變的靶頭,進(jìn)而通過MRI監(jiān)測藥物的靶向性及體內(nèi)分布。

實(shí)驗(yàn)中,通過0.5T NM I20-Analyst和PQ 001核磁共振儀分別測定了BSA-(Gd-DTPA)26和Gd-DTPA在32℃時(shí)的橫向和縱向弛豫時(shí)間,分別得到了T 1和T 2的反演和擬合曲線,具體形象地反映了兩種造影劑的弛豫特點(diǎn),并且通過公式計(jì)算出兩種造影劑在5mmol/L時(shí)的弛豫率。公式1/To=1/Tw+ri×C,是在忽略溶質(zhì)分子相互作用的前提下得到的[12],而且一般僅適用于稀溶液,本實(shí)驗(yàn)中溶液的濃度較稀,可以按照該公式來計(jì)算弛豫率,預(yù)實(shí)驗(yàn)中,根據(jù)不同濃度造影劑R1/R2值擬合的曲線呈線性關(guān)系,綜合考慮,在誤差允許的范圍內(nèi),利用該公式計(jì)算造影劑的弛豫率是可信的。另外考慮到造影劑進(jìn)入人體后,需通過血漿的存儲和運(yùn)輸,與單純的純水的環(huán)境有所不同。因此,造影劑在純水中的弛豫率不能完全代表其在人體血液中的弛豫性能。血清白蛋白 (serum albumin)是哺乳動物體內(nèi)多種內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的存儲、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,也是血漿中含量最豐富的具有許多生理功能的蛋白質(zhì)之一。因此本研究在測定造影劑在純水中的弛豫率外,還測定了造影劑在牛血清白蛋白溶液中的弛豫性能,對了解此類造影劑在體內(nèi)的作用過程具有重要意義?？疾爝^程中,仍沿用上述公式計(jì)算其弛豫率,但是該公式能否適用于造影劑的白蛋白溶液尚待進(jìn)一步研究。

小鼠急性毒性實(shí)驗(yàn)表明造影劑在診斷所需劑量下毒性較低。但是不排除來自于體內(nèi)其他金屬離子或小分子配體的競爭配位,從而破壞了體內(nèi)的生化平衡,導(dǎo)致一定的毒性,在應(yīng)用于臨床前,應(yīng)考慮將其進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?使其達(dá)到在體內(nèi)弛豫性能和安全性能的雙重保障。

大鼠磁共振增強(qiáng)掃描初步揭示了BSA-(Gd-DTPA)n的長循環(huán)性能,該性能有利于其多時(shí)相顯示血管及分支,且有利于靶向造影劑靶向頭基與病灶的充分結(jié)合。但是過長的半衰期勢必會影響到非特異性背景的及時(shí)清除,給成像時(shí)機(jī)的選擇帶來一定的困難。后續(xù)的研究將進(jìn)一步具體定量BSA-(Gd-DTPA)n的血漿半衰期,從而為造影劑前體BSA-(Gd-DTPA)n的優(yōu)化提供一定的依據(jù)。

致 謝

本實(shí)驗(yàn)中造影劑弛豫率的測量得到上海紐邁電子科技有限公司的鼎立協(xié)助,特此致謝。