王利華 周 平 周 鵬 何 煒 李興華

肝臟原發(fā)性惡性腫瘤是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,兔肝VX 2腫瘤模型是目前較成熟的應(yīng)用于肝癌臨床前期實(shí)驗(yàn)的大型動(dòng)物模型,在肝癌影像診斷學(xué)、抗癌藥物藥代動(dòng)力學(xué)、腫瘤化療方法及介入治療學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用[1,2]。超聲造影技術(shù)是近年來(lái)才發(fā)展起來(lái)的影像技術(shù),被譽(yù)為超聲醫(yī)學(xué)的第三次革命,可較好地應(yīng)用于腫瘤的血供評(píng)估[3,4]。本實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用超聲造影技術(shù)來(lái)檢測(cè)不同階段兔肝VX 2腫瘤的血供情況,以評(píng)估超聲造影在兔肝VX2腫瘤模型演變?cè)u(píng)估中的價(jià)值。

方 法

1.動(dòng)物模型制作

新西蘭大白兔30只,體重2.0～2.5kg,平均2.28kg,雌雄不限,購(gòu)自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動(dòng)物學(xué)部。肝腫瘤模型制備過(guò)程如下:在無(wú)菌條件下手術(shù)剝離荷瘤兔肝VX 2實(shí)體瘤塊,生理鹽水沖洗,去除結(jié)締組織,選取腫瘤邊緣生長(zhǎng)旺盛的魚(yú)肉樣組織,制成大小約1.0mm×1.0mm×1.0mm的瘤塊備用。兔術(shù)前禁食、禁水8h,3%戊巴比妥鈉(劑量30mg/kg)耳緣靜脈麻醉后固定在兔臺(tái)上,青霉素40萬(wàn)U靜脈推注預(yù)防感染,備皮后常規(guī)消毒鋪巾。于兔上腹部劍突下作一正中縱行切口,長(zhǎng)3.0cm左右,逐層進(jìn)入腹腔暴露肝臟后,將兔肝左葉牽出體外,用眼科鑷夾取一腫瘤組織塊,將瘤塊植入肝實(shí)質(zhì)較厚處,然后將明膠海綿1～2塊(每塊大小約1.0mm×1.0mm×1.0mm)填塞并緊貼在肝表面?zhèn)谔?。確認(rèn)無(wú)活動(dòng)性出血后將肝臟放回腹腔,后逐層關(guān)腹。兔術(shù)后均給予青霉素40萬(wàn)U肌注,待蘇醒后送回兔籠觀察。后每天給予青霉素8萬(wàn)U肌注。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及指標(biāo)觀察

圖1 兔肝VX 2腫瘤超聲造影動(dòng)脈相表現(xiàn)。A.為整體增強(qiáng)。B.為不均勻性增強(qiáng)。C.為周邊環(huán)狀增強(qiáng)。

將30只荷瘤兔隨機(jī)分成3組,每組10只,術(shù)后16天對(duì)第1組、術(shù)后28天對(duì)第2組、術(shù)后42天第3組荷瘤兔進(jìn)行超聲檢查,每次檢查儀器設(shè)置條件一致。先用二維超聲掃查肝臟及腫瘤,選取腫瘤最大切面進(jìn)入超聲造影模式,采用低機(jī)械指數(shù)狀態(tài)(M I≤0.12),調(diào)節(jié)合適參數(shù)(深度、聚焦、總增益、TGC等)并保持不變,經(jīng)耳緣靜脈團(tuán)注0.1ml/kg SF6微泡懸浮液(按說(shuō)明書(shū)配制)每次注射后立即尾隨注入1ml生理鹽水沖管,注射造影劑同時(shí)啟動(dòng)超聲儀內(nèi)置計(jì)時(shí)器,實(shí)時(shí)不間斷觀察病灶的灌注及回聲強(qiáng)度變化,所有影像均存儲(chǔ)于主機(jī)硬盤(pán)內(nèi)。脫機(jī)處理圖片,于動(dòng)脈相測(cè)量腫瘤的最大直徑,測(cè)量水平及垂直兩個(gè)方向上的直徑a、b,得最大直徑(a+b)/2。并由兩名CEUS臨床診斷經(jīng)驗(yàn)豐富的高年資醫(yī)師分析造影劑灌注情況。

超聲造影后立即常規(guī)處死荷瘤兔,取肝臟腫瘤組織及周圍正常肝組織標(biāo)本,選取腫瘤最大剖面測(cè)量最大直徑,方法同上,再行大體及顯微組織病理檢查。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,超聲造影動(dòng)脈相與大體標(biāo)本測(cè)量腫瘤最大直徑的兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn);超聲造影動(dòng)脈相測(cè)得的三組腫瘤最大直徑以x±s差表示,進(jìn)行q檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料進(jìn)行R×C表資料的Chi-square檢驗(yàn),P＜0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.兔肝VX 2腫瘤模型的超聲造影檢查

超聲造影動(dòng)脈相與大體標(biāo)本測(cè)量腫瘤最大直徑的兩組數(shù)據(jù)比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.10)。超聲造影動(dòng)脈相測(cè)得三組兔肝VX 2腫瘤最大直徑:第1組(術(shù)后 16天):1.37±0.05cm,第2組 (術(shù)后 28天):2.02±0.09cm,第 3組(術(shù)后42天):2.39±0.12cm。三組數(shù)據(jù)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。30只荷瘤兔VX 2腫瘤超聲造影強(qiáng)化方式均呈 “快進(jìn)快出”型,即在動(dòng)脈相迅速增強(qiáng),門(mén)脈相迅速廓清,低于周圍正常肝實(shí)質(zhì),類似于一般惡性腫瘤最常見(jiàn)的超聲造影表現(xiàn)。VX 2腫瘤在動(dòng)脈相呈現(xiàn)三種增強(qiáng)模式(圖1):整體增強(qiáng)、不均勻性增強(qiáng)、周邊環(huán)狀增強(qiáng),三組兔肝VX 2腫瘤在動(dòng)脈相增強(qiáng)模式上存在差異 (P＜0.05)(表1)。其中第1組主要表現(xiàn)為整體增強(qiáng)(6/10),第2組主要表現(xiàn)為不均勻性增強(qiáng)(6/10),而第3組主要表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強(qiáng)(9/10)。

2.組織病理學(xué)檢查

2.1大體觀察(圖2):腫瘤呈類圓形,質(zhì)地較硬,無(wú)明顯包膜形成,切面呈灰白色魚(yú)肉狀。本實(shí)驗(yàn)6個(gè)動(dòng)脈相表現(xiàn)為整體增強(qiáng)的VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示結(jié)節(jié)質(zhì)地較均勻,瘤內(nèi)無(wú)明顯壞死灶;10個(gè)動(dòng)脈相表現(xiàn)為瘤內(nèi)不均勻性增強(qiáng)的VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示瘤內(nèi)可見(jiàn)散在乳糜樣壞死灶;14個(gè)動(dòng)脈相表現(xiàn)為瘤周環(huán)狀增強(qiáng)VX 2瘤結(jié)節(jié),病理結(jié)果顯示瘤結(jié)節(jié)中心形成單個(gè)囊腔壞死灶,腔內(nèi)為渾濁液體,部分為血性液體。

2.2H-E染色(圖3):VX 2腫瘤組織細(xì)胞在肝內(nèi)呈浸潤(rùn)性癌巢,與肝實(shí)質(zhì)無(wú)明顯邊界,間質(zhì)分界不清,結(jié)締組織多少不等,癌巢邊緣見(jiàn)浸潤(rùn)狀肝索結(jié)構(gòu);細(xì)胞呈不規(guī)則排列,瘤細(xì)胞體積大,形態(tài)不規(guī)則,胞質(zhì)豐富,淡紅染色,核肥大,其大小及形態(tài)各異,染色濃淡不均,核分裂像多見(jiàn),間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。壞死組織呈大片紅染,其內(nèi)正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失。

表1 兔肝VX 2腫瘤模型超聲造影動(dòng)脈相的增強(qiáng)模式(例)

討 論

VX 2細(xì)胞株起源于Shope病毒誘發(fā)的兔乳頭狀瘤衍生的鱗癌,經(jīng)過(guò)72次移植傳代后建立了細(xì)胞株VX 2,它可接種于兔的肝臟、腎臟、肌肉等組織器官內(nèi)制成原位腫瘤動(dòng)物模型[5,6]。兔肝VX 2腫瘤模型一般可分為三個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期[7]:①實(shí)質(zhì)期(種植后2～3周):大量腫瘤血管生成,在VX 2瘤周邊形成大量粗細(xì)不均、雜亂的供瘤血管,并有穿支血管伸入腫瘤內(nèi)部;②壞死期(4～5周):腫瘤血管生成趨于穩(wěn)定,瘤體生長(zhǎng)快于血管生成,腫瘤中央因缺血而出現(xiàn)壞死;③囊變期(6～7周):腫瘤血管退化,瘤中央大片液化形成囊腔。由于兔肝VX 2腫瘤血供特點(diǎn)及生長(zhǎng)特性類似人類肝細(xì)胞肝癌,常被用于肝腫瘤影像診斷學(xué)、抗癌藥物藥代動(dòng)力學(xué)、化療及介入治療學(xué)等方面的基礎(chǔ)研究。

超聲造影為血池造影,采用可進(jìn)入組織微循環(huán)的造影劑和低機(jī)械指數(shù)連續(xù)成像方法,能夠?qū)崟r(shí)動(dòng)態(tài)地觀測(cè)實(shí)質(zhì)組織的微血管結(jié)構(gòu),反映病變組織的血流灌注情況。本實(shí)驗(yàn)兔肝VX 2腫瘤超聲造影呈現(xiàn)“快進(jìn)快出”型強(qiáng)化方式?？赡苁且?yàn)?兔肝VX 2腫瘤的血供主要來(lái)自肝動(dòng)脈[8],供養(yǎng)VX 2腫瘤的肝動(dòng)脈血管內(nèi)造影劑較靜脈內(nèi)的造影劑少,經(jīng)過(guò)一次微循環(huán)而先到達(dá)腫瘤組織,因此形成腫瘤血管動(dòng)脈相迅速增強(qiáng)的影像。肝實(shí)質(zhì)主要由門(mén)靜脈供血,在門(mén)靜脈灌注后肝實(shí)質(zhì)開(kāi)始明顯增強(qiáng),而瘤體內(nèi)因缺乏門(mén)靜脈滋養(yǎng)并且腫瘤新生血管發(fā)育多不成熟,由肝動(dòng)脈來(lái)的造影劑可以通過(guò)“短路”途徑快速廓清而顯示負(fù)性低增強(qiáng)區(qū),呈現(xiàn)“快出”現(xiàn)象,從而使腫瘤與正常肝實(shí)質(zhì)形成明顯回聲“缺失”的影像反差,即呈現(xiàn)“快進(jìn)快出”型強(qiáng)化方式。

兔肝VX 2腫瘤在二維超聲上呈等回聲、低回聲或稍高回聲,其中以等回聲多見(jiàn),與周圍正常肝實(shí)質(zhì)灰階對(duì)比不明顯,腫瘤邊界顯示欠清晰,故在測(cè)量上會(huì)有較大誤差。本組采用超聲造影對(duì)30個(gè)兔肝VX 2腫瘤進(jìn)行了測(cè)量,發(fā)現(xiàn)測(cè)量結(jié)果與病理結(jié)果相似,與文獻(xiàn)報(bào)道一致[9,10]。說(shuō)明超聲造影在兔肝VX 2腫瘤測(cè)量方面有明顯的優(yōu)勢(shì),這主要是因?yàn)樵趧?dòng)脈相造影劑迅速充填腫瘤血管,呈“燈泡征”,腫瘤與周圍肝組織灰階對(duì)比明顯增強(qiáng),從而可清晰顯示腫瘤及其邊界,有利于準(zhǔn)確進(jìn)行測(cè)量。本組采用超聲造影還對(duì)不同階段組的兔肝VX 2腫瘤進(jìn)行測(cè)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)第3組大于第2組,第2組大于第1組(P＜0.05),說(shuō)明隨著時(shí)間的推移,兔肝VX 2腫瘤呈逐漸增大趨勢(shì)。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)30個(gè)兔肝VX 2腫瘤,有6個(gè)VX 2瘤結(jié)節(jié)表現(xiàn)為動(dòng)脈相整體增強(qiáng),病理結(jié)果顯示瘤內(nèi)無(wú)明顯壞死灶;24個(gè)VX 2瘤結(jié)節(jié)表現(xiàn)為動(dòng)脈相瘤內(nèi)不均勻性增強(qiáng)或周邊環(huán)狀增強(qiáng),與病理結(jié)果顯示的壞死范圍一致,說(shuō)明我們可以根據(jù)腫瘤在動(dòng)脈相的增強(qiáng)模式來(lái)準(zhǔn)確判斷腫瘤的血供狀態(tài)及壞死范圍。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)處于不同生長(zhǎng)階段的兔肝VX 2腫瘤在動(dòng)脈相增強(qiáng)模式進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn):實(shí)質(zhì)期(第1組)主要呈整體增強(qiáng)(6/10),壞死期(第2組)主要呈不均勻性增強(qiáng)(6/10),囊變期(第3組)主要呈周邊環(huán)形增強(qiáng)(9/10)?？赡艿脑?兔肝VX 2腫瘤早期腫瘤細(xì)胞即開(kāi)始釋放各種血管新生因子,腫瘤新血管開(kāi)始生成,逐漸形成以動(dòng)脈為基礎(chǔ)的腫瘤滋養(yǎng)血管網(wǎng),隨著腫瘤的增長(zhǎng),瘤周及瘤內(nèi)血流逐漸豐富。當(dāng)腫瘤直徑超過(guò)2mm時(shí),毛細(xì)血管大量形成,血管增多、增粗,大約在2～3周(實(shí)質(zhì)期)瘤灶新生血管生長(zhǎng)最旺盛,故此期的兔VX 2肝腫瘤在動(dòng)脈相主要表現(xiàn)為整體增強(qiáng)。此后由于瘤體增長(zhǎng)快于血管增生,瘤中心部因缺血而形成壞死灶,VX 2瘤進(jìn)入壞死期(4～5周),此時(shí)動(dòng)脈相主要呈不均勻增強(qiáng)(壞死灶無(wú)增強(qiáng),腫瘤組織迅速增強(qiáng))。6～7周(囊變期)瘤體血管增生明顯減緩,血管退化,瘤體因缺乏血供而大部分壞死,呈大片液化壞死灶并形成囊腔,僅存瘤周少量環(huán)狀血管。故此時(shí)動(dòng)脈相主要表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強(qiáng),本實(shí)驗(yàn)中第1組有4只荷瘤兔腫瘤超聲造影表現(xiàn)為不均勻性增強(qiáng)或周邊環(huán)狀增強(qiáng),說(shuō)明瘤內(nèi)出現(xiàn)了壞死灶,提前進(jìn)入了壞死期;第2組有4只荷瘤兔腫瘤超聲造影表現(xiàn)為周邊環(huán)狀增強(qiáng)。說(shuō)明壞死范圍較大,提前進(jìn)入了囊變期;而第3組有1只荷瘤兔瘤灶呈不均性增強(qiáng),說(shuō)明瘤灶生長(zhǎng)緩慢,尚處于壞死期。這可能是由于荷瘤兔存在個(gè)體差異的緣故。

綜上所述,超聲造影可準(zhǔn)確測(cè)量出兔肝VX 2腫瘤直徑及變化趨勢(shì),即隨著時(shí)間的推移,腫瘤呈逐漸增大的趨勢(shì);可根據(jù)腫瘤在動(dòng)脈相的增強(qiáng)模式來(lái)準(zhǔn)確判斷腫瘤的血供狀態(tài)及壞死范圍。超聲造影能較好地評(píng)估兔肝VX 2腫瘤的演變過(guò)程,為兔肝VX 2腫瘤模型實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。