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近年來,我國某些省份一些群眾被蜱叮后發(fā)生無形體感染或疑似無形體感染,為之,特將國內(nèi)外有關(guān)人粒細(xì)胞無形體病的調(diào)研工作概述如下。

1990-1993年間,在美國Minnesota和Wisconsin州發(fā)現(xiàn)多個(gè)急性發(fā)熱的病人的中性粒細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)有埃立克體樣包涵體。血清學(xué)分析也證明這些病人與人單核細(xì)胞埃立克體病(Human monocytic ehrlichiosis,HME)的病原體(Ehrlichia chaf f eensis)無關(guān),而與馬埃立克體(E.equi)和嗜吞噬細(xì)胞埃立克體(E.phagocytophilium)相關(guān)。1994年,Chen等用PCR從病人血標(biāo)本擴(kuò)增到該嗜粒細(xì)胞病原體的16S rRNA基因,經(jīng)序列分析證明該病原體與馬埃立克體和嗜吞噬細(xì)胞埃立克體密切相關(guān)〔1〕。1995年,Goodman等用人的粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系(H L-60)從病人血標(biāo)本分離到該嗜粒細(xì)胞病原體,將它命名為人粒細(xì)胞埃立克體,其所致感染則稱為人粒細(xì)胞埃立克體病(Human granulocytic ehrlichiosis,HGE)〔2〕。經(jīng) 16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,發(fā)現(xiàn)這些從動(dòng)物與人分得的嗜粒細(xì)胞病原體與無形體屬病原體最相關(guān),因此將它們歸為無形體屬的一個(gè)新種,正式命名為無形體科(Anaplasmataceae)內(nèi)無形體屬(Anaplasma)的一個(gè)種(嗜吞噬細(xì)胞無形體A.phagocytophilum),其所致感染改為人粒細(xì)胞無形體病(Human granulocytic anaplasmosis,HGA)〔3〕。

1 病原特征

1.1 形態(tài)結(jié)構(gòu) 嗜吞噬細(xì)胞無形體呈球狀多型性,主要寄生在粒細(xì)胞的胞質(zhì)空泡內(nèi),幾個(gè)或十幾個(gè)菌體聚集形成的一個(gè)包涵體〔4〕。用Wright法染色,嗜吞噬細(xì)胞無形體包涵體在胞質(zhì)內(nèi)染成紫紅色,見圖1。

人粒細(xì)胞白血病細(xì)胞(HL-60)類似人的正常骨髓前質(zhì)細(xì)胞,具有嗜中性粒細(xì)胞的功能。嗜吞噬細(xì)胞無形體在H L-60細(xì)胞內(nèi)生長繁殖十分迅速,電鏡觀察發(fā)現(xiàn)它在HL-60細(xì)胞內(nèi)主要存在與膜結(jié)構(gòu)相連的空泡內(nèi)。嗜吞噬細(xì)胞無形體早期的形態(tài)多為圓形的密度較大的網(wǎng)狀體,在后期菌體變小但密度增大 ,見圖 2〔5〕。

1.2 抗原結(jié)構(gòu) 嗜吞噬細(xì)胞無形體的44 kDa外膜蛋白基因全長1 333 bp,編碼439個(gè)氨基酸。嗜吞噬細(xì)胞無形體的染色體上有多個(gè)與44 kDa外膜蛋白基因同源的基因,存在一個(gè)44 kDa外膜蛋白基因家族〔6〕。用嗜吞噬細(xì)胞無形體感染血清篩選該病原體的基因文庫,發(fā)現(xiàn)該病原體的160 kDa、130 kDa和100 kDa等3個(gè)大分子抗原蛋白基因。另外,生物素標(biāo)記嗜吞噬細(xì)胞無形體的蛋白質(zhì)組分析發(fā)現(xiàn)Omp85 、Asp62、Asp55、P44、Omp-1A 等5 個(gè)主要表面蛋白,其中Asp62和Asp55能夠與HGA患者血清所識(shí)別〔7〕。

1.3 基因組 嗜吞噬細(xì)胞無形體的基因組為1,471,282 bp,G+C含量為41.6%,含有1,369個(gè)編碼框〔8〕。該小基因組經(jīng)過多次減數(shù)進(jìn)化已經(jīng)丟失許多功能基因,因此嗜吞噬細(xì)胞無形體必須依賴宿主細(xì)胞生長、繁殖,但其仍具有核酸、維生素、輔因子合成基因〔8〕。從病人分離的嗜吞噬細(xì)胞無形體與從馬和牛分離的嗜吞噬無形體的16S rRNA基因的差異僅1～3個(gè)堿基(0.1～0.2%),充分證明它們屬于同一個(gè)種〔3〕。

2 流行病學(xué)

在美國有21個(gè)州發(fā)現(xiàn)HGA,主要集中在東北部,中西部和西海岸也有病人。僅1998年被查證HGA病人有數(shù)百病例。血清學(xué)分析證明某些歐洲國家也有該病的存在,在斯洛文尼亞已有多個(gè)HGA病例被證實(shí)。我國學(xué)者用嗜吞噬細(xì)胞無形體特異PCR檢查蜱咬后發(fā)熱病人的血標(biāo)本,獲得陽性結(jié)果〔8〕,并發(fā)現(xiàn) HGA 病例或疑似 HGA 病例〔8-9〕,我國學(xué)者已從東北地區(qū)的野鼠和發(fā)病羊血標(biāo)本分離到3株嗜吞噬細(xì)胞無形體〔10〕。

2.1 傳播媒介 美國每年的4月到 12月均有HGA病例出現(xiàn),但高峰期為6月和7月,與流行地的蜱活動(dòng)期相吻合,已證實(shí)肩突硬蜱是該病的傳播媒介。肩突硬蜱是也是萊姆病病原體的攜帶和傳播者,用PCR方法從HGA流行區(qū)的肩突硬蜱中同時(shí)擴(kuò)增出HGA和萊姆病病原體DNA〔7〕。另外美國肩突硬蜱還是微小巴比原蟲(Babesia microti)、某些腦炎病毒的攜帶和傳播者,約10%的HGA患者有萊姆病或巴比原蟲病共感染的血清學(xué)證明〔11〕。

全鉤硬蜱為我國主要硬蜱屬蜱(I.persulcatus),為萊姆病的傳播媒介。我國學(xué)者采用嗜吞噬細(xì)胞無形體特異PCR檢測(cè)新疆、內(nèi)蒙、黑龍江等地的全溝硬蜱,陽性率分別為3.2%、6.3%、0.8%〔8〕。

2.2 自然宿主 美國肩突硬蜱寄生于白尾鹿(Odocoileusvirginianus)身上,研究證明美國的白尾鹿是嗜吞噬細(xì)胞無形體的貯存宿主〔7〕。另外,在實(shí)驗(yàn)室用肩突硬蜱和小鼠成功地模擬出嗜吞噬細(xì)胞無形體在蜱與嚙齒動(dòng)物之間循環(huán),證明野外嚙齒動(dòng)物是嗜吞噬細(xì)胞無形體的重要貯存宿主。

3 發(fā)病機(jī)制

嗜吞噬細(xì)胞無形體通過蜱叮咬進(jìn)入體內(nèi),經(jīng)微血管或淋巴道進(jìn)入血流和臟器。采用免疫組化在HGA病人和實(shí)驗(yàn)感染動(dòng)物的肝、脾、骨髓和淋巴結(jié)等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的器官組織中均發(fā)現(xiàn)嗜吞噬細(xì)胞無形體〔11〕。

3.1 嗜吞噬無形體直接損傷宿主細(xì)胞〔2,11〕嗜吞噬細(xì)胞無形體進(jìn)入血流后,其主要寄生于嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)。嗜吞噬細(xì)胞無形體的嗜中性粒細(xì)胞特性可能與它表面存在的選凝素-P(P-selectin)配體有關(guān)。用抗白細(xì)胞選凝素配體的單克隆抗體預(yù)先與嗜吞噬細(xì)胞無形體結(jié)合,可以阻止嗜吞噬細(xì)胞無形體與嗜中性粒細(xì)胞結(jié)合以及其后的細(xì)胞內(nèi)入侵。嗜吞噬細(xì)胞無形體在吞噬細(xì)胞內(nèi)生長和過量繁殖可直接引起細(xì)胞的裂解。另外還發(fā)現(xiàn)粒細(xì)胞系和單核細(xì)胞系的初始骨髓祖細(xì)胞對(duì)嗜吞噬細(xì)胞無形體感染敏感,這可能是HGA病人的白細(xì)胞計(jì)數(shù)下降的一個(gè)重要原因。

3.2 嗜吞噬細(xì)胞無形體抑制噬中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)〔12-13〕嗜中性粒細(xì)胞在機(jī)體的防御系統(tǒng)中是一主要效應(yīng)細(xì)胞。嗜中性粒細(xì)胞吞噬入侵的病原菌后發(fā)生呼吸爆發(fā),產(chǎn)生大量的超氧離子(O2-),超氧離子能夠有效地殺傷病原菌。但是,嗜吞噬細(xì)胞無形體在嗜中性粒細(xì)胞內(nèi)不但不損傷,而且在細(xì)胞內(nèi)大量繁殖,證明嗜吞噬細(xì)胞無形體能夠抑制嗜中性粒細(xì)胞的呼吸爆發(fā)。

3.3 HGA的病理損傷與機(jī)體免疫因素有關(guān)〔11,14〕

嗜吞噬細(xì)胞無形體侵入組織的吞噬細(xì)胞后引起機(jī)體的免疫應(yīng)答,免疫應(yīng)答使淋巴細(xì)胞和吞噬細(xì)胞在感染部位浸潤造成局部組織的炎性損傷,免疫應(yīng)答的某些免疫細(xì)胞激活和細(xì)胞因子的釋放可加重嗜吞噬細(xì)胞無形體感染后的組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)γ干擾素在感染早期可促進(jìn)體內(nèi)嗜吞噬細(xì)胞無形體清除,后期卻使組織損傷加重。

3.4 病理學(xué)檢查〔7,11〕通過對(duì)HGA死亡病人 尸檢和組織病理學(xué)檢查,發(fā)現(xiàn)嗜吞噬細(xì)胞無形體的主要靶細(xì)胞為成熟的粒細(xì)胞,免疫組化檢查發(fā)現(xiàn)血液、脾臟、肺、肝臟等器官的嗜中性粒細(xì)胞中存在嗜吞噬細(xì)胞無形體,感染器官組織有較明顯的病理改變。

檢查死者脾臟發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤、漿細(xì)胞數(shù)量的增加,并可見噬紅細(xì)胞和白細(xì)胞現(xiàn)象以及細(xì)胞凋亡。淋巴結(jié)檢查也發(fā)現(xiàn)類似脾臟的病變。一死亡兒童的尸檢發(fā)現(xiàn)有明顯的淋巴腺炎,其淋巴結(jié)組織有嚴(yán)重的嗜中性粒細(xì)胞浸潤和巨噬細(xì)胞聚集以及副皮質(zhì)增生。HGA病人的骨髓檢查發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞浸潤和漿細(xì)胞數(shù)量增加,泡沫樣組織細(xì)胞增多和噬紅細(xì)胞現(xiàn)象。

肝臟組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)有淋巴細(xì)胞浸潤,并有淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞等細(xì)胞的聚集;肝臟的Kuppfer細(xì)胞數(shù)量增加且發(fā)現(xiàn)有肝細(xì)胞的凋亡等。肺的病理改變主要為肺間質(zhì)的淋巴細(xì)胞浸潤、肺組織水腫、肺泡內(nèi)出血等。

4 臨床特征

4.1 臨床表現(xiàn) 根據(jù)Bakken等對(duì)確診的41例HGA病人的觀察,它們的平均潛伏期為8天,所有的病人均有發(fā)熱合并寒戰(zhàn),絕大部分有疲乏、肌痛〔4〕;白細(xì)胞減少、血小板減少以及轉(zhuǎn)氨酶升高是HGA臨床診斷的重要依據(jù);急性呼吸窘迫綜合征或/和急性腎衰是HGA患者死亡的主要原因,死亡多見于有繼發(fā)感染的老年患者,死亡率為HGA住院病人的7～10%〔4,7,11〕。HGA 患者少見出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)異常,其它臨床表現(xiàn)見表1。

表1 41例HGA的臨床表現(xiàn)

4.2 診斷與鑒別診斷〔7,11〕對(duì)有類似于感冒癥狀的發(fā)熱病人,特別是有血小板減少和白細(xì)胞減少,并有蜱接觸史者,應(yīng)當(dāng)考慮到HGA。HGA需與其它的蜱媒病原體所致的發(fā)熱性疾病相鑒別,其它的蜱媒病原體感染一般無血小板減少。HGA的臨床特征和臨床診斷要點(diǎn)與HME基本相同,它們之間的相互鑒別早期主要依賴病原學(xué)檢查,后期可通過血清學(xué)方法進(jìn)行鑒別。

因?yàn)榧缤挥豺鐬镠GA和萊姆病的共同傳播媒介,其可以同時(shí)攜帶嗜吞噬細(xì)胞無形體和萊姆病螺旋體,它的叮咬也可使人同時(shí)患有HGA和萊姆病。在用四環(huán)素類藥物治療無效時(shí)應(yīng)考慮病人是否有萊姆病或其它病原體感染。某些病毒性感染也可以導(dǎo)致白細(xì)胞、血小板減少,因此需要與這些病毒性感染相鑒別。HGA的確診有賴于多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)、血清學(xué)、病原分離等實(shí)驗(yàn)室診斷。

5 實(shí)驗(yàn)室檢查

5.1 一般檢查 絕大多數(shù)的HGA病例有血小板減少和多伴有白細(xì)胞減少,絕大多數(shù)病例有血清肝轉(zhuǎn)氨酶水平升高。

5.2 直接涂片鏡檢 取病人的外周血直接涂片,作Wright's、Diff-Quik或 Giemsa染色,可發(fā)現(xiàn) HGA病人的中性粒細(xì)胞胞質(zhì)中有圓形桑椹狀包涵體(Morula)。感染早期(第1w)檢查中性粒細(xì)胞內(nèi)包涵體是最有效的早期 HGA診斷方法,陽性率在25%～ 75%〔4,7,11〕。

5.3 血清學(xué)檢測(cè) 用嗜吞噬細(xì)胞無形體感染的HL-60細(xì)胞制備抗原片作間接免疫熒光分析(IFA),檢測(cè)病人血清中的抗嗜吞噬細(xì)胞無形體特異性抗體滴度。但是在感染的早期,大部分病人的檢測(cè)結(jié)果為陰性,因此該方法檢查結(jié)果無早期診斷價(jià)值〔4,7,11〕。

5.4 PCR檢測(cè) 采用套式PCR擴(kuò)增病人血標(biāo)本中的嗜吞噬細(xì)胞無形體的16S rRNA基因片段,多數(shù)HGA病人的急性期血標(biāo)本檢測(cè)為陽性〔15〕。

5.5 病原體分離 將病人的抗凝血或從血中分離的白細(xì)胞接種于含有H L-60細(xì)胞懸液,大約1w后,經(jīng)細(xì)胞涂片染色,可見細(xì)胞內(nèi)有小包涵體,2w后幾乎100%細(xì)胞被嗜吞噬細(xì)胞無形體感染〔4,7〕。

6 治療與預(yù)防

HGA的治療首選強(qiáng)力霉素,其它四環(huán)素類藥物也有效。大多數(shù)患者用強(qiáng)力霉素治療后2d內(nèi)開始退熱。體外藥物敏感試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在HL-60細(xì)胞內(nèi)的嗜吞噬細(xì)胞無形體除對(duì)強(qiáng)力霉素敏感外,利福平、環(huán)丙沙星、氧氟沙星等藥物對(duì)它也有好的殺傷作用〔4,7,11〕。

HGA預(yù)防主要是在野外防止蜱對(duì)人的叮咬,可采用適當(dāng)?shù)臍⑾x劑殺滅居住地的蜱和寵物身上的蜱〔7,11〕。

〔1〕Chen SM,Dumler JS,Bakken JS,et al.Identification of a granulocyticEhrlichiaspecies as the etiologic agent of human disease〔J〕.J Clin Microbiol,1994;32：584-595.

〔2〕Goodman JL,Nelson C,Vitale B,et al.Direct cultivation of the causative agent of human granulocy tic ehrlichiosis〔J〕.New Eng J M ed,1996,334：209-215.

〔3〕Dumler JS,Barbet AF,Bekker CP,et al.Reorganization of genera in the families rickettsiaceae and anaplasmataceae in the order rickettsiales：unification of some species ofEhrlichiawithAnaplasma,CowdriawithEhrlichiaandEhrlichiawithNeorickettsia,descriptions of six new species combinations and designation ofEhrlichia equiand HGE agent'as subjective synonyms ofEhrlichia phagocy tophila〔J〕.Int J Syst Evol Microbiol,2001,51：2145-65.

〔4〕Bakken JS,Krueth J,Wilson-Nordskog C,Tilden RL,et al.Clinical and laboratory characteristics of human granulocy tic ehrlichiosis〔J〕.JAMA,1996,275：199-205.

〔5〕Wen B,Cao W,Pan H.Ehrlichiaeand Ehrlichial diseases in China〔J〕.A nn N Y Acad Sci,2003,900：45-53.

〔6〕Ijdo JW,Sun W,Zhang Y,et al.Cloning of the gene encoding the 44-kilodalton antigen of the agent of human granulocytic ehrlichiosis and characterization of the humoral response〔J〕.Infect Immun,1998,66：3264-3269.

〔7〕Dumler JC,Madigan JE,Pusterla N,et al.Ehrlichoses in humans：epidemiology,clinical presentation,diagnosis,and treatment〔J〕.Clin Infect Dis,2007,45 Suppl 1：S45-51.

〔8〕Walker DH,Dumler JS.Emergence of the ehrlichioses as human health problems〔J〕.Emerg Infect Dis,1996,2 ：18 29.

〔9〕Zhang L,Liu Y,Ni D,et al.Nosocomial transmission of human granulocy tic anaplasmosis in China〔J〕.JAMA,2008,300：2263-2270.

〔10〕Zhan L,Cao WC,Jiang JF,et al.Anaplasma phagocytophilumfrom Rodents and Sheep,China〔J〕.Emerg Infect Dis,16 ：724-768.

〔11〕Ismail N,Bloch KC,McBride JW.Human Ehrlichiosis and Anaplasmosis〔J〕.Clin Lab M ed.2010 Mar;30(1)：261-92.

〔12〕Banerjee R,A nguita J,Roos D,et al.Cutting edge：infection by the agent of human granulocy tic ehrlichiosis prevents the respiratory burst by down-regulating gp91phox〔J〕.J Immumol,2000,164：3947-3949.

〔13〕M ott J,Rikihisa Y.Human granulocytic ehrlichiosis agent inhibits superoxide anion generation by human neutrophils〔J〕.Infect immune,2000,68：6697-6703.

〔14〕Nartin ME,Caspersen K,Dumler JS.Immunopathology and ehrlichial propagation are regulated by interferon-γand interleukin-10 in a murine model of human granulocytic ehrlichiosis〔J〕.AJP,2001,158：1881-1888.

〔15〕Anderson BE,Sumner JW,Dawson JE,et al.Detection of the etiologic agent of human ehrlichiosis by polymerase chain reaction〔J〕.J Clin Microbiol,1992,30 ：775-80.