王廷安,沈海英,申云俠,王文波,王本敬,梁幼生,諸葛洪祥

2.江蘇省血吸蟲病防治研究所,無錫 214064

該法能檢測出1條尾蚴提取的DNA分子〔3〕。受此啟發(fā),將之推廣用于鑒別水體中日本血吸蟲毛蚴的試驗,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和釘螺 昆明小鼠,由蘇州大學(xué)實驗動物中心提供,體重為23±2g。陽性釘螺購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。

1.2 主要儀器和試劑 梯度PCR儀(Mastercycler gradient 5331,Eppendorf,德國產(chǎn)),凝膠成像系統(tǒng)(Genegenius,SYNGENE,英國產(chǎn)),超速冷凍離心機(jī)(AllegraTM21 R centrifuge,BECKMAN COULTER,美國產(chǎn)),生物分光光度計(Biophotometer,Eppendorf,德國產(chǎn)),轉(zhuǎn)移電泳儀(DYY-Ⅲ6,北京六一儀器廠產(chǎn))。蛋白酶K(購自 TAKARA,批號為CB23O2A),DNA標(biāo)志物(100bp的 DNA marker ladder,購自TIANGEN公司,批號為G5410),Taq DNA酶(購自寶生物工程(大連)有限公司,批號為CK 4501CA)。

1.3 動物感染 固定小鼠,腹部剃毛用去氯水濕潤后將計數(shù)好的載有尾蚴的蓋玻片貼于暴露的小鼠皮膚上,每只小鼠感染 40±5條,20min后去除蓋玻片〔4〕。

1.4 毛蚴的孵化和富集 感染6～8 w后解剖小鼠,取約20g肝臟研磨,用1.2%生理鹽水沉淀肝臟組織以獲取血吸蟲卵,按羅金萍的改良血吸蟲毛蚴孵化法〔5〕進(jìn)行孵化,并利用間接連續(xù)離心法富集毛蚴,備用。

1.5 模板DNA的制備 取上述富集毛蚴的EP管,加入200μL細(xì)胞裂解液,混勻,置于 37。C水浴鍋中過夜,采用蛋白酶K-苯酚法并參照〔6〕提取毛蚴基因組DNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定,備用。

1.6 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中的日本血吸蟲18S-rDNA基因序列(DQ442999),應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件和Oligo 6軟件,設(shè)計1對特異性引物,擴(kuò)增片段長度為463 bp。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成:

引物 1:5′-ATTCCGATAACGAACGAGAC-3′

引物 2:5′-AAGCCACTACAACGACACCA-3′

1.7 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物鑒定 PCR反應(yīng)體系(25μL):模板DNA 2.0μL,dNTPs 1.0μL,10×PCR 緩沖液 2.5μL, 上、下游引物各1.0μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL,滅菌雙蒸水17.0μL。94。C變性 5min,94。C變性 20s,56。C退火 30s,72。C延伸40s,共 30個循環(huán),最后 72。C延伸 5min,結(jié)束后4。C等待。取各PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL,2μL 6×上樣緩沖液混合,6μL DNA marker ladder標(biāo)志物,1.5%的瓊脂糖凝膠電泳30min后轉(zhuǎn)移到含有溴化乙錠(EB)的搪瓷盤里浸染25min,在凝膠圖像分析系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍攝圖像。根據(jù)DNA標(biāo)志物,樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在463 bp位置處出現(xiàn)紅橙熒光帶即為陽性,否則為陰性。得到擴(kuò)增產(chǎn)物的日本血吸蟲毛蚴DNA,作為以后梯度稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增的陽性對照模板DNA。

1.8 梯度稀釋檢測PCR的靈敏性試驗 用eppendorf Biophotometer測定日本血吸蟲毛蚴的DNA濃度,用TE緩沖溶液先稀釋5倍再以2倍倍比稀釋日本血吸蟲毛蚴DNA溶液,依次為 1∶5、1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280及1∶2 560,按選定的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增,并用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR的靈敏性和特異性。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白酶K-苯酚法抽提毛蚴基因組DNA 經(jīng)過間接連續(xù)離心法富集的毛蚴,加入細(xì)胞裂解液37。C過夜處理后,再加入等體積的平衡酚,分層明顯且產(chǎn)生大量乳白色物質(zhì)見圖1。抽提的毛蚴DNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后有清晰條帶,見圖2效果良好。

圖1 蛋白酶K-苯酚法抽提毛蚴DNAFig.1 The miracidium DNA was extracted by Proteinase K-phend method

2.2 PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳 日本血吸蟲毛蚴DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳后,得到一條約463bp的條帶,與靶DNA片段位置相同,而陰性對照組則無擴(kuò)增產(chǎn)物見圖3。

2.3 梯度稀釋檢測PCR的靈敏性試驗 取日本血吸蟲毛蚴DNA溶液5μL,稀釋20倍后用eppendorf BioPhotometer測定日本血吸蟲毛蚴的DNA濃度為 4μg/mL,其中 A 260/A 280為 1.33,A 260/A 230為1.53。通過梯度稀釋后發(fā)現(xiàn),PCR方法可檢測出特異性條帶的最大稀釋比為1∶1 280,即可檢測出日本血吸蟲毛蚴DNA的最小濃度為62.5 pg/μL,稀釋比1∶2 560組和陰性對照組均無擴(kuò)增產(chǎn)物見圖4。

圖4 梯度稀釋檢測PCR的靈敏性試驗M:DNA Marker(100bp),1:陽性對照,2～11:日本血吸蟲毛蚴(稀釋度分別為1∶5,1∶10,1∶20,1∶40,1∶80,1∶160,1∶320,1∶640,1∶1 280及 1∶2 560),12:陰性對照。Fig.4 The specificity and massdetection experiments of PCR assay

3 討 論

準(zhǔn)確靈敏地檢測水中是否含有日本血吸蟲毛蚴與尾蚴,對可能接觸疫水的人群和牲畜及時預(yù)警,并對疫區(qū)水體和周邊環(huán)境及時處理,控制血吸蟲病流行,鞏固血吸蟲防治的效果具有重要意義。雖然對尾蚴的監(jiān)測是通過灘涂投放哨鼠,可以監(jiān)測血吸蟲尾蚴分布。但是,這種檢測方法周期性長、影響因素多,成本大。近年研究資料表明,檢測血吸蟲DNA的PCR 技術(shù)已經(jīng)建立。Hanelt等〔7〕根據(jù)曼氏血吸蟲18S rDNA基因設(shè)計了兩對引物,建立了巢式PCR(nest-PCR),其實驗過程比較繁瑣。陳一平等〔8〕通過巢式PCR能夠檢測到單個蟲卵、單個尾蚴或者針尖大小的成蟲組織,且與人類基因組和腸道細(xì)菌無交叉陽性出現(xiàn)。陳軍虎等〔9〕根據(jù)日本血吸蟲18S r RNA基因設(shè)計了一對引物,建立了檢測日本血吸蟲感染性釘螺的PCR方法。周立等〔10〕運(yùn)用實時熒光定量PCR法檢測日本血吸蟲DNA,最低檢測濃度約為6pg。秦圓方等〔11〕建立的檢測日本血吸蟲感染的SYBR Green熒光定量PCR法可在每200mg糞樣僅含1個蟲卵時,熒光定量PCR結(jié)果呈陽性。但對檢測日本血吸蟲毛蚴的PCR方法,目前國內(nèi)外尚未見專門的研究報道。在漫長的生物進(jìn)化過程中,真核生物的18S rDNA基因為保守序列,進(jìn)化速率慢,這些序列在不同個體中堿基差異不大,保守性好,用這些多拷貝基因序列進(jìn)行檢測,可以增強(qiáng)擴(kuò)增靈敏度。

本研究利用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0和Oligo 6自主設(shè)計了特異性引物,采用間接連續(xù)離心法富集毛蚴,蛋白酶K-苯酚法提取毛蚴基因組DNA,并以日本血吸蟲保守序列18S rDNA基因作為靶片段,選擇了合適的PCR反應(yīng)體系和條件,建立了檢測日本血吸蟲毛蚴的PCR方法。本研究表明,PCR擴(kuò)增日本血吸蟲毛蚴DNA,得到了與靶片段位置相同的特異性條帶,特異性很強(qiáng);梯度稀釋檢測PCR的靈敏性試驗顯示,PCR方法可檢測出特異性條帶的最大稀釋比為1∶1 280,即可檢測出日本血吸蟲毛蚴DNA的最小濃度為62.5 pg/μL,靈敏性極好,具有很大的潛力推廣應(yīng)用于現(xiàn)場檢測水體中日本血吸蟲毛蚴,可起到一定的預(yù)警作用。

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