李麗婷 許文濤, 郭 星 姚業(yè)成 黃昆侖,

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院1,北京 100083)

(農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗監(jiān)督測試中心2,北京 100083)

提取鼠腸道內(nèi)微生物基因組DNA 的方法研究

李麗婷1許文濤1,2郭 星2姚業(yè)成1黃昆侖1,2

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院1,北京 100083)

(農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢驗監(jiān)督測試中心2,北京 100083)

通過改進鼠腸道微生物基因組DNA提取方法以期更全面地反映鼠腸道菌群的真實情況。采用CTAB和 SDS結(jié)合的方法裂解細胞,同時改進了傳統(tǒng)的酚/氯仿抽提方法,提取全過程控制在 2 h以內(nèi)。通過紫外分光光度計,細菌通用引物 PCR,總菌群實時定量 PCR,變性梯度凝膠電泳 (DGGE)對改進方法及兩種試劑盒法提取 DNA的結(jié)果進行比較,評價了所建立的高效提取方法。與試劑盒相比,改進的方法 DNA得率較高,簡便快速,成本低廉。同時后續(xù)的 PCR鑒定及DGGE菌群多樣性分析顯示,改進的方法可以更好地揭示鼠腸道菌群分布和特性。

鼠腸道微生物 DNA提取方法 CTAB/SDS實時定量 PCR 變性梯度凝膠電泳

鼠腸道內(nèi)是一個復(fù)雜的生態(tài)體系,含有 500～1 000種細菌,總數(shù)高達 1013～1014,其包含的基因數(shù)目是自身基因組的 100倍[1]。腸道微生物群落與宿主個體的健康和疾病狀況息息相關(guān),它不僅能降解食物中不可消化的營養(yǎng)成分、提供宿主維生素等營養(yǎng)物質(zhì),還能促進腸上皮細胞的分化與成熟、激活腸道免疫系統(tǒng)以及調(diào)節(jié)宿主能量存儲與代謝[2]。因此,越來越多的研究人員已經(jīng)認識到腸道微生態(tài)研究的重要意義。

從腸道樣品中提取的 DNA被廣泛的用于遺傳和生態(tài)學(xué)研究中。近年來,現(xiàn)代分子生物學(xué)方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR),實時定量 PCR(real-time PCR),變性梯度凝膠電泳 (DGGE),限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP),隨機擴增的多態(tài)性DNA(RAPD)等技術(shù)廣泛用于分析腸道微生物多樣性[3-6]。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法很難全面地反映腸道菌群的結(jié)構(gòu)特征,而現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)不依賴于微生物培養(yǎng),可以從腸道樣品中分出更多具體的微生物屬種,從而進一步揭示了腸道中微生物菌群結(jié)構(gòu)的分布。然而,前面所提到的以 PCR分子技術(shù)為核心的試驗結(jié)果很大程度上依賴于腸道微生物中 DNA模板的質(zhì)量和數(shù)量,也就是說提取好的 DNA是分子生物學(xué)研究的關(guān)鍵一步。因此,很多研究者都報告了不同樣品的傳統(tǒng)DNA提取法的改良方法[7-9],各種DNA提取試劑盒的應(yīng)用也很廣泛。然而大多數(shù)傳統(tǒng)方法復(fù)雜又耗時,還用到了有毒試劑和價格高的試劑,如β-巰基乙醇,溶菌酶等;很多 DNA提取試劑盒的價格偏高,不適合處理大批量的樣品,而且有些試劑盒的 DNA產(chǎn)量相對較低[10],不適合做后續(xù)分子生物學(xué)的研究。目前市面上還沒有專門用于從動物腸道中提取微生物基因組 DNA的試劑盒。因此,尋找一種適宜的方法是進一步研究鼠腸道菌群的當(dāng)務(wù)之急。

本試驗采用一種改進的高效快速的 DNA提取方法,并與兩種常用 DNA提取試劑盒做比較,通過實時定量 PCR和DGGE考察不同提取方法的優(yōu)劣和對后續(xù)分子生物學(xué)研究的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料及試劑

鼠腸道內(nèi)容物樣品:新鮮的腸道內(nèi)容物從乙醚處理過的 SD大鼠盲腸中得到。樣品收集在盛滿冰的無菌袋中,立即被送到實驗室,真空冷凍干燥后,-80℃冷凍保藏。

Qiagen DNA StoolMini Kit:德國 Qiagen公司;TI2 ANamp細菌基因組DNA提取試劑盒:天根生化科技有限公司;PCR擴增試劑盒 (dNTPs、Buffer、Taq酶 ),引物:大連寶生物公司;SYBR Green MasterMix:日本 TOYOBO公司;Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、醋酸鈉、無水乙醇 (分析純):科昊達生物技術(shù)公司;瓊脂糖 (分析純):西班牙 biowest公司;丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、去離子甲酰胺 (超級純):Amresco公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

AB I-2720 PCR擴增儀:美國 Applied Biosystems公司;AB I7000實時定量 PCR擴增儀:美國 Applied Biosystems公司;CLASSⅡ TYPE B2 PCR生物安全柜:哈東連儀器設(shè)備廠;5804R型離心機:德國 Ep2 pendorf公司;CHEM I-S MART 3000WL/LC熒光凝膠成像系統(tǒng):法國 VilberLour mat公司;UV IKON系列紫外可見分光光度計:法國 Secomam公司;電泳儀,DCode通用突變檢測系統(tǒng):美國 Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 改良的酚 /氯仿抽提法

取約 50 mg腸道內(nèi)容物樣品各 3個,用液氮研磨5 min,分別置于 2 mL小離心管,加入 lmL TE緩沖液(pH 8.0,10 mmol/L Tris-HCl,1 mmol/L EDTA-Na2),振蕩均質(zhì)后 12 000 r/min離心 5 min,去上清液,沉淀中再加入 1 mL TE緩沖液,重復(fù)操作一遍。在離心得到的沉淀中加入 0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%SDS混勻,37℃保溫 20 min。加入 5 mol/L NaC1,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%的 CTAB和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的抗壞血酸各 0.2 mL,65℃保溫 20 min。用等體積Tris-飽和酚 ∶氯仿 ∶異戊醇 (25∶24∶1)抽提,12 000 r/min離心5 min。取上清,重復(fù)操作一次。取上清;再加入等體積氯仿 ∶異戊醇 (24∶1),12 000 r/min離心 5 min。加入 1/10體積 3 mol/L NaAC,及 1倍體積異丙醇,液氮中放置 10 min立即取出。12 000 r/min離心 5 min取沉淀,用 70%乙醇洗滌一次,于室溫晾干。沉淀用 100μL TE緩沖液溶解,加RNA酶 (5μL/100μL)37℃保溫 10 min,-20℃保存?zhèn)溆?。整個過程在 2 h左右。

1.3.2 TI ANamp細菌基因組 DNA提取試劑盒法

取約 50 mg腸道內(nèi)容物樣品各 3個,按照試劑盒的使用說明提取腸道菌群 DNA,溶于 100μL TE緩沖液中。

1.3.3 Qiagen DNA StoolMini Kit提取法

取約 50 mg腸道內(nèi)容物樣品各 3個,按照試劑盒的使用說明提取腸道菌群 DNA,溶于 100μL TE緩沖液中。

1.3.4 DNA質(zhì)量檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳、Gold Veiw染色、凝膠成像儀觀察分析;紫外分光光度計分別在波長 260 nm和280 nm處檢測樣品總 DNA濃度和純度,最后計算DNA得率。

1.3.5 總細菌通用引物 PCR

擴增通用引物為:上游引物 338f(5’-ACTC2 CTACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物 518r(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’),其中上游引物帶一個 GC串 (CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGC GGGGGCACGGGGGG),擴增菌群的 16S r DNA V3區(qū),由大連寶生物公司合成。擴增反應(yīng)體系為25μL,組成為:1×PCR緩沖液 (含 3%MgCl2),0.2 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L雙引物,1μL模板DNA和 0.025 U/μLTaq酶。擴增程序為預(yù)變性94℃5 min、35個循環(huán) (94℃變性 30 s、58℃退火30 s、72℃延伸 30 s),72℃延伸 5 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳,Gold Vei w染色后用凝膠成像儀觀察分析。

1.3.6 實時熒光定量 PCR(SYBR Green I)

檢測樣品基因組 DNA引物如下,擴增片段大小為 466 bp:F:5’-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-3’;R:5’-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3’。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建:用紫外分光光度計測定大腸桿菌純菌株 (Escherichia coli)DNA的 OD值及濃度,換算為標(biāo)準(zhǔn)菌株的拷貝數(shù) (1.33×108),分別做10倍系列稀釋的大腸桿菌純菌株 DNA(10-1～10-5),用上述引物擴增,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

實時定量 PCR反應(yīng)體系及條件:總體積 30μL,包含 15μL 2×SYBRGreen Master Mix,引物(0.6μmol/L),DNA模板 1μL。PCR擴增反應(yīng)條件:首先 95 ℃ 5 min;然后 95 ℃ 15 s、58 ℃ 30 s、72℃30 s進行 30個循環(huán);熔點曲線分析 95℃15 s,60 ℃20 s,95 ℃15 s。

樣品的檢測:每種提取方法分別取 3個樣,每個樣做一個重復(fù),反應(yīng)體系及條件如上所述,結(jié)果 Ct值取平均,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算菌群數(shù)量,用 log genome/g樣品表示。

1.3.7 DGGE(變性梯度凝膠電泳)

DGGE在 DCode通用突變檢測系統(tǒng)上運行,聚丙烯酰胺凝膠濃度 8%～12%(37.5∶1,丙烯酰胺 /甲叉雙丙烯酰胺),電泳緩沖液 0.5×TAE(20 mmol/L Tris-acetate,pH 7.4,10 mmol/L乙酸鈉,0.5 mmol/L Na2EDTA),變性梯度 35%～60%(100%指的是 7 mol/L尿素和體積分?jǐn)?shù)為 40%去離子甲酰胺),電泳溫度 59°C,電壓 60 V,10 min然后跑160 V,4 h。SYBR Green I染色 30 min,用熒光凝膠成像儀照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓊脂糖凝膠電泳觀察不同方法提取的鼠腸道微生物基因組 DNA效果

TI ANamp細菌基因組 DNA提取試劑盒是專門從各種革蘭氏陰性、陽性細菌中快速提取到高質(zhì)量的基因組DNA,試驗用這種試劑盒提取鼠腸道內(nèi)總菌群基因組 DNA,如圖 1所示,在瓊脂糖凝膠電泳圖上幾乎不可見,說明其用于腸道內(nèi)總菌群的提取效率較低,DNA模板數(shù)較少。Qiagen DNA Stool Mini Kit使用硅膠膜技術(shù),從新鮮或冷凍糞便或其他帶有高濃度 PCR抑制劑樣品中純化提取基因組 DNA。在本試驗中,Q I Aamp DNA Stool Mini Kit和改進的酚/氯仿抽提方法提取的基因組 DNA在瓊脂糖凝膠電泳圖上的條帶都很亮,彌散較少,體現(xiàn)了改進酚/氯仿抽提法的優(yōu)越性。

圖 1 三種不同方法提取的腸道基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 紫外分光光度計檢測鼠腸道菌群總 DNA質(zhì)量

如表 1統(tǒng)計結(jié)果所示,三種不同提取方法均能達到 DNA純度要求 (1.8～2.0之間)。就濃度和得率來看,高效酚/氯仿抽提法和 Qiagen DNA Stool Mini Kit法的 DNA產(chǎn)量均較高,其中高效酚 -氯仿抽提法比 Qiagen DNA StoolMini Kit法稍好一些,而TI ANamp細菌DNA試劑盒的濃度和得率只有上述兩種方法的 1/3左右。

表 1 紫外分光光度法檢測 3種方法提取的樣品菌群總DNA濃度、純度及得率

2.3 三種不同方法提取的腸道菌群DNA的應(yīng)用考察

2.3.1 細菌通用引物 PCR

從圖 2可見,使用細菌通用引物擴增,擴增片斷根據(jù)腸道內(nèi)細菌的種類分布在 200 bp左右。T IANa2 mp試劑盒法提取的菌群基因組 PCR產(chǎn)物亮度低,說明其起始模板拷貝數(shù)低或含有某些 PCR抑制因子。高效酚 -氯仿抽提法提取的菌群基因組 DNA經(jīng)過擴增后的產(chǎn)物主帶清晰明亮,無明顯彌散帶,無 RNA殘留,說明其模板拷貝數(shù)最高,PCR抑制因子相對較少。

圖 2 鼠腸道菌群基因組DNA的 16S r DNA擴增電泳圖

2.3.2 SYBR GreenⅠ熒光染料實時定量 PCR

圖 3 不同稀釋濃度的總菌群的實時定量 PCR擴增曲線圖

如圖 3擴增曲線和圖 4標(biāo)準(zhǔn)曲線表明,循環(huán)閾值(Ct值)與標(biāo)準(zhǔn)菌株拷貝數(shù)的對數(shù)之間存在顯著的線性關(guān)系 (R2=0.995 1),為待測樣品的定量提供了參照標(biāo)準(zhǔn)。從圖 5擴增曲線圖可以看出,不同處理的樣品總菌群數(shù)有明顯差異,從左到右分別為改進的酚 /氯仿法,Qiagen試劑盒法及 TI ANamp試劑盒法提取的樣品。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線,經(jīng)過統(tǒng)計計算得出改進的酚 /氯仿法得到的總菌群數(shù) (log genome/g樣品)為 11.51±0.03,Qiagen試劑盒法為 10.85±0.14,TI ANamp試劑盒法為 8.47±0.10。從圖 6熔解曲線可以看出,不同方法提取腸道菌群 DNA的 PCR產(chǎn)物特異性好,條帶單一,測得的數(shù)據(jù)可靠。結(jié)果表明,改進的酚/氯仿法和 Qiagen試劑盒法能得到較高的菌群數(shù)量,其中改良的方法更好一些,而用 TI ANamp試劑盒法得到的菌群數(shù)量明顯較低,僅是改良酚 /氯仿法的 1/1 000。

2.3.3 DGGE菌群多樣性分析

為了進一步考察三種不同方法在菌群分布方面的應(yīng)用性和可靠性,試驗對所提取基因組的 PCR產(chǎn)物進行了 DGGE電泳分析,如圖 7所示,7～9泳道的條帶最多,說明該法提取的微生物多樣性豐富,而 1～3泳道的條帶最少,說明微生物多樣性相對貧乏。由此可知,改進的酚/氯仿法提取的 DNA有利于后續(xù)的微生物多樣性分析,可以更全面地揭示菌群特征及其分布,而其它兩種試劑盒法 (尤其是 TI ANamp試劑盒法)提取的DNA明顯不足以進行 DGGE電泳分析。

圖 7 三種不同方法提取基因組的DGGE圖譜

3 討論

試驗結(jié)果根據(jù)樣品保存和提取方法的不同有很大差別[11],首先應(yīng)該根據(jù)樣品的特性選擇提取DNA的適宜方法[12]。鼠腸道內(nèi)是一個復(fù)雜的環(huán)境,不僅寄生著上千種菌群,還有未完全消化的食物殘渣,腐殖質(zhì),腸壁上脫落的內(nèi)皮細胞,各種有機物和無機物等[13]。其中存在很多的 PCR抑制因子 (如多糖,脲,腐酸或者血紅素),能夠輕微抑制或者完全抑制 PCR的擴增,因此對于在進行 DNA提取前對樣品進行前處理以去除抑制因子是很有必要的[14]。

試驗采用真空冷凍干燥的方法對腸道內(nèi)容物進行預(yù)處理,可以最低限度地減少 DNA在保存期的降解。在前處理時采用液氮研磨樣品,方便細胞破碎和DNA的釋放,同時在低溫環(huán)境下可以抑制DNA酶的降解作用。應(yīng)用 TE緩沖液二次清洗,高速離心后上清液基本澄清,說明已經(jīng)去除了腸道菌群中的顆粒雜質(zhì)和色素。盡可能的收集糞便中的腸道菌,使得到的總 DNA能較全面地反映腸道菌群結(jié)構(gòu)的特征。菌體細胞裂解的效率直接影響獲取基因組DNA的質(zhì)量,采用 CTAB和 SDS結(jié)合的方法裂解細胞去除蛋白提取 DNA,取得了很好的效果。PCR試驗結(jié)果說明改進的酚/氯仿抽提法在一定程度上去除了PCR抑制因子的不利影響。通過 DGGE分析,可以看到提取質(zhì)量高的DNA,菌群豐富度相對較大,有利于后續(xù)的分子生物學(xué)研究。

綜合起來,本試驗方法有如下優(yōu)點:(1)改進的酚 /氯仿提取法 DNA得率更高,且對后續(xù) PCR反應(yīng)的不利影響最小。(2)節(jié)省了大量成本,只用到一些基本的試劑如 Tris-飽和酚,氯仿,SDS,CTAB等,用量很小,且不需要溶菌酶,蛋白酶 K等價格較高的試驗藥品,很適合處理大批量樣品。(3)試驗時間短于一般的傳統(tǒng)酚/氯仿提取法,如操作熟練,能控制在2 h內(nèi)完成。

4 結(jié)論

4.1 改良后的酚 /氯仿法所提取的腸道菌群基因組數(shù)量達 11.51(log genome/g樣品),顯著高于 TI ANa2 mp試劑盒法得到的菌群數(shù)量,同時在成本上要優(yōu)于Qiagen試劑盒法,是一個提取鼠腸道微生物基因組行之有效的方法,特別適用于處理大批量樣品。

4.2 實時熒光定量 PCR是目前常用的分子生物學(xué)檢測手段之一,能夠快速精確地測定菌群基因組拷貝數(shù),在檢測過程中 SYBR GreenⅠ熒光染料發(fā)出強熒光信號,結(jié)合在 DNA雙鏈的小溝部位,其熒光量與擴增產(chǎn)物量成正比,每個循環(huán)的延伸階段收集信號監(jiān)測 DNA的擴增數(shù)量,就可以推出起始模板量[15],而紫外分光光度計在 DNA濃度比較低時,就會測不準(zhǔn)甚至測不出來數(shù)值。因此實時熒光定量PCR在用于腸道菌群檢測的準(zhǔn)確性和敏感度上要遠遠優(yōu)于傳統(tǒng)的紫外分光光度計。

4.3 改良后的酚/氯仿法所提取的腸道菌群 DNA通過DGGE菌群多樣性分析,可更全面地揭示鼠腸道微生物群落分布,有利于對整體菌群的變化或針對某一菌種進行檢測研究。

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An EffectiveMethod for Genomic DNA Extraction from Rat IntestinalMicroflora

LiLiting1XuWentao1,2Guo Xing2Yao Yecheng1Huang Kunlun1,2
(College of Food Science and Nutrition Engineering,China AgriculturalUniversity1,Beijing 100083)
(Supervision,Inspection and Testing Center of GeneticallyModified Orgini sms,Ministry ofAgriculture2,Beijing 100083)

A modifiedmethod for extractingmicrobial communityDNA from rat intestinal samples to fully reflect the real situation of rat intestinalmicroflora is described in this paper.Combination of CTAB and SDS was used for cell lysis,the traditional DNA extraction method was i mproved,and the whole process was controlled within two hours.Thismodified method and other two DNA extraction kitswere evaluated byUV spectrophotometer,bacterial u2 niversal primer PCR,real-time quantitative PCR and denaturing gradient gel electrophoresis(DGGE).Results show the modified method has a higher yield of DNA and it is simple,rapid and cost-effective compared with the other t wo kits.The PCR and DGGE show that the modified method can reveal the distribution and trait of rat intesti2 nalmicroflora better.

rat intestinal microflora,DNA extraction method,CTAB/SDS,real-time quantitative PCR,DGGE

Q-33

A

1003-0174(2010)01-0122-06

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃 863項目(2006AA10Z440),國家自然科學(xué)基金項目(2007-Z8)

2009-01-21

李麗婷,女,1983年出生,碩士,營養(yǎng)與食品安全

黃昆侖,男,1968年出生,副教授,博士生導(dǎo)師,轉(zhuǎn)基因生物安全評價與檢測技術(shù)