戴 國(guó)，李 燁，彭 彬，徐 倩，汪保和

(湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 中國(guó) 長(zhǎng)沙 410081)

N-乙?；?絲氨酰-天冬氨酰-賴氨酰-脯氨酸(N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline, AcSDKP)是細(xì)胞生長(zhǎng)的一種生理性調(diào)控因子，是在胎牛骨髓中發(fā)現(xiàn)的[1]．AcSDKP能阻止造血干/祖細(xì)胞進(jìn)入S期，使之停留在Go期，抑制它們的增殖[2-3]．進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，AcSDKP對(duì)非造血細(xì)胞如淋巴細(xì)胞，腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞等有生長(zhǎng)抑制作用[4]，對(duì)心肌、肺組織纖維化也有一定的抵抗作用[5-6]．作者所在實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，AcSDKP能抑制體外培養(yǎng)條件下人和小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)的增殖[7]．本研究的主要目的是通過(guò)分離、純化和培養(yǎng)人骨髓MSCs，觀察AcSDKP對(duì)這種成體干細(xì)胞增殖周期的影響，為闡明該因子對(duì)MSCs的增殖調(diào)控機(jī)制提供新的論據(jù)．

1 材料和方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基(低糖)、卡托普利、胰蛋白酶、AcSDKP、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、碘化丙啶(PI)、5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)為Sigma公司產(chǎn)品．胎牛血清(FBS)購(gòu)于杭州四季青公司．淋巴細(xì)胞分離液(1.077±0.002 g/L)為上海國(guó)藥集團(tuán)生化公司產(chǎn)品．小鼠抗人BrdU抗體購(gòu)于Oncogene Science公司；生物素化羊抗小鼠IgG、DAB顯色試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物公司．培養(yǎng)器皿為Costar公司產(chǎn)品．

1.2 人骨髓單個(gè)核細(xì)胞的分離

從中南大學(xué)湘雅醫(yī)院胸外科獲取擇期手術(shù)切口中摘除的肋骨段，病人無(wú)血液系統(tǒng)疾患且無(wú)肋骨病變．在無(wú)菌條件下剪成約3 cm小段，用DMEM培養(yǎng)液沖出骨髓，依次用帶7號(hào)、6號(hào)、4號(hào)針頭的注射器將骨髓懸液吸打各3次，制成單細(xì)胞懸液．將單細(xì)胞懸液加于淋巴細(xì)胞分離液上，1 500 r/min離心10 min，收集中間層單個(gè)核細(xì)胞，用DMEM重懸所收細(xì)胞，洗2次，計(jì)數(shù)備用．

1.3 MSC的純化和傳代培養(yǎng)

取骨髓單個(gè)核細(xì)胞混于20%(體積分?jǐn)?shù)，下同)FBS的DMEM液中，懸液含細(xì)胞5×106個(gè)/mL，種入塑料培養(yǎng)瓶，于35 ℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)．3 d后更換一次培養(yǎng)液，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)，至細(xì)胞增殖而鋪滿瓶底約90%面積時(shí)，用胰蛋白酶消化法收集細(xì)胞，于同樣培養(yǎng)體系和條件下傳代培養(yǎng)，以擴(kuò)增和純化人骨髓MSC．

1.4 BrdU摻入法

取第3代MSC，接種于內(nèi)置一蓋玻片的35 mm塑料培養(yǎng)皿中，細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL．分4組進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組加入20%FBS的DMEM，另3組在對(duì)照組基礎(chǔ)上添加AcSDKP，終濃度分別為1×10-9，1×10-10和1×10-11mol/L．培養(yǎng)5 d后加入BrdU(終濃度為30 μmol/L), 繼續(xù)培養(yǎng)2 h．取出蓋玻片，按試劑盒說(shuō)明書依次操作如下：PBS洗3次，4%多聚甲醛固定30 min．滴加0.3%H2O2:甲醇，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶．滴加5%正常兔血清封閉液，室溫20 min．甲酰胺100 ℃, 5 min變性核酸．滴加小鼠抗BrdU單抗(工作濃度1∶250)，4 ℃過(guò)夜．滴加生物素化羊抗小鼠IgG(1∶100)，37 ℃，20 min．加SABC(鏈酶親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物)，37 ℃，20 min．DAB(3,3-二氨基聯(lián)苯胺)顯色．陰性對(duì)照：同樣條件下培養(yǎng)的未加BrdU的 MSC．隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野中細(xì)胞總數(shù)及BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算標(biāo)記指數(shù)(LI)[8]．

標(biāo)記指數(shù)(LI)=標(biāo)記細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%．

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

將濃度分別為1×10-10，1×10-11，1×10-12mol/L 的AcSDKP添加組與對(duì)照組培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)至接種后第5天，細(xì)胞80%融合時(shí)，胰蛋白酶消化法收集細(xì)胞，以1×106個(gè)細(xì)胞密度懸浮細(xì)胞，經(jīng)熒光染料碘化丙錠(PI)溶液避光染色30 min，流式細(xì)胞儀488 nm檢測(cè)，獲取DNA含量分布組方圖，確定各期細(xì)胞數(shù)．

1.6 MTT比色法

取傳代培養(yǎng)第3代的MSC，分5組接種于24孔塑料培養(yǎng)板，5×103個(gè)細(xì)胞/孔，第一組(對(duì)照組)添加20%FBS的DMEM；在對(duì)照組基礎(chǔ)上，第二至五組加AcSDKP(終濃度分別為1×10-12，1×10-11，1×10-10，1×10-9mol/ L)，同時(shí)加入卡托普利(終質(zhì)量濃度為10-6μg/L)．按前述條件培養(yǎng)24 h后小心吸去懸液，MTT檢測(cè)，490 nm波長(zhǎng)下讀取A值(absorbance value)．重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次．

1.7 AcSDKP對(duì)MSC集落生成抑制作用可逆性的檢測(cè)

將人骨髓單個(gè)核細(xì)胞混于20%FBS的DMEM中，培養(yǎng)體系含細(xì)胞2×106個(gè)/mL，種入12孔塑料培養(yǎng)板，每孔1 mL．35 ℃、5%CO2、飽和濕度下培養(yǎng)．3 d后，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，吸去各孔的培養(yǎng)上懸液和未貼壁的細(xì)胞，分4組(3孔/組)做第一次換液．第一、二組換入20%FBS的DMEM，第三、四組加終濃度為1×10-11mol/ L AcSDKP的20%FBS DMEM，同時(shí)加入卡托普利(終質(zhì)量濃度為10-6μg/L)．在相同培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)3 d，吸去上懸液，用DMEM輕輕刷洗一次培養(yǎng)孔，按前分組第二次換液．第一組為(1)不換液的不添加AcSDKP組；第二組仍換入20%FBS的DMEM，為(2)換液前后均不添加AcSDKP組；第三組仍換入終濃度為1×10-11mol/ L AcSDKP，為(3)換液后繼續(xù)添加AcSDKP的全程作用組；第四組換入不含AcSDKP的20%的FBS的DMEM，為(4)換液撤除AcSDKP組．同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 d，瑞氏-吉姆薩(Wrighte-Giemsia)染色，光鏡下計(jì)數(shù)MSC集落(≥50個(gè)成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞的細(xì)胞聚合定為一個(gè)MSC集落)．

1.8 不同血清濃度條件下AcSDKP影響MSC生長(zhǎng)的集落形成實(shí)驗(yàn)

配含F(xiàn)BS體積分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%和40%的人MSC集落培養(yǎng)體系，每一濃度包含2個(gè)組，其中一組添加AcSDKP(終濃度為1×10-11mol/L)；另一組不添加AcSDKP．按前所述培養(yǎng)后，計(jì)數(shù)MSC集落，并按下式計(jì)算各FBS濃度點(diǎn)AcSDKP對(duì)MSC集落生成的抑制率：

抑制率=(不加AcSDKP組集落數(shù)-AcSDKP添加組集落數(shù))/不加AcSDKP組集落數(shù)×100%.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨髓MSC的體外生長(zhǎng)狀況

圖1 傳代培養(yǎng)的第3代人骨髓MSC(Scale bar, 20 μm)

骨髓單個(gè)核細(xì)胞種于塑料培養(yǎng)瓶培養(yǎng)3 d后，在倒置顯微鏡下可見(jiàn)單個(gè)或少量集落生長(zhǎng)的貼壁細(xì)胞，形態(tài)大多呈短梭形或針尖狀，有一個(gè)核位于中央，可見(jiàn)核仁．10～15 d后，細(xì)胞集落不斷擴(kuò)大并形成融合單層，細(xì)胞形態(tài)大多呈長(zhǎng)梭形或多角形．傳代培養(yǎng)中，細(xì)胞24 h內(nèi)完全貼壁、伸展，重新變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，呈均勻分布，增殖迅速，培養(yǎng)7～10 d即達(dá)到完全融合 (圖1)．黏附于貼壁細(xì)胞之上的造血細(xì)胞和其他細(xì)胞在換液的過(guò)程中逐漸減少而幾近消失．在本實(shí)驗(yàn)條件下，人骨髓MSC能在體外擴(kuò)增10代左右．

2.2 AcSDKP作用下人骨髓MSC的BrdU摻入試驗(yàn)結(jié)果

10-11mol/L的AcSDKP添加組標(biāo)記指數(shù)(LI)為(5.93±1.08)%，與對(duì)照組(10.57±1.36)%相比，差異有高度顯著意義(P< 0.01)．10-9mol/L和10-10mol/L AcSDKP添加組的LI分別為(8.07±0.55)%和(6.73±0.52)%，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)顯著性(P<0.05)．

2.3 AcSDKP作用下人骨髓MSC細(xì)胞周期的FCM分析結(jié)果

FCM檢測(cè)不同濃度AcSDKP培養(yǎng)條件下人骨髓MSC的DNA含量，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，獲得細(xì)胞周期各時(shí)相細(xì)胞的百分率(見(jiàn)表1)．AcSDKP添加組與對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞比例增加，S+G2/M期細(xì)胞比例減少，差異有顯著意義(P<0.05)(圖2)．

表1 不同濃度AcSDKP培養(yǎng)條件下人骨髓MSC的細(xì)胞周期狀態(tài)

**P<0.01 and*P<0.05, compared with control. Data were from three separate experiments.

A.control；B.treated by 10-10 mol/ L AcSDKP；C.treated by 10-11 mol/L AcSDKP;D.treated by 10-12 mol/ L AcSDKP圖2 AcSDKP對(duì)人骨髓MSC細(xì)胞周期的影響

2.4 AcSDKP對(duì)人骨髓MSC生長(zhǎng)抑制作用的可逆性

如圖3所示，不換液不加AcSDKP組、換液不加AcSDKP組、換液加 AcSDKP組和換液撤除AcSDKP組的集落生成數(shù)分別為(22.46±1.96)，(22.84±1.61)，(11.50±1.83)，(17.51±1.05)個(gè)/106BMMNC．換液后撤除AcSDKP組的集落生成數(shù)與對(duì)照組比較有顯著差異(P<0.01)，MSC生長(zhǎng)得到了一定程度的恢復(fù)．

2.5 不同血清濃度下AcSDKP對(duì)人骨髓MSC的增殖抑制效應(yīng)

如圖4顯示，在FBS為10%、20%、30%的條件下，AcSDKP添加組的集落數(shù)明顯小于對(duì)照組(P<0.05)；而FBS體積分?jǐn)?shù)為40%AcSDKP添加組與對(duì)照組之間集落生成數(shù)差異無(wú)顯著性意義(P>0.05)．在FBS體積分?jǐn)?shù)為40%AcSDKP添加組中抑制率也最低．

A為不換液不加AcSDKP組；B為換液不加AcSDKP組；C為換液加AcSDKP組；D為換液撤除AcSDKP組.圖3 培養(yǎng)體系中撤除AcSDKP后MSC生長(zhǎng)的恢復(fù)

**P<0.01 and *P<0.05, compared with control. Data were from three separate experiments圖4 不同血清濃度下AcSDKP對(duì)人骨髓MSC生長(zhǎng)的影響

2.6 AcSDKP對(duì)人骨髓MSC貼壁的影響

**P<0.01 and *P<0.05, compared with control. Data were from three separate experiments圖5 AcSDKP作用下人骨髓MSC傳代培養(yǎng)24 h后的MTT試驗(yàn)吸光值

結(jié)果如圖5所示，在傳代培養(yǎng)的第3代人骨髓MSC培養(yǎng)體系中加入濃度為10-12～10-9mol/L的AcSDKP，24 h后做MTT檢測(cè)，AcSDKP各濃度組的吸光值(A值)均明顯低于對(duì)照組(P<0.01 或P<0.05)，10-11mol/L濃度組的A值最低．

3 討論

干細(xì)胞的增殖受多種調(diào)控因素的影響，其中細(xì)胞因子的作用尤為重要．AcSDKP對(duì)造血干/祖細(xì)胞的增殖具有負(fù)調(diào)控作用[9-10]；但對(duì)白血病細(xì)胞及HL-60細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用[11]．人們希望將AcSDKP用作抗癌治療的干細(xì)胞保護(hù)劑．我室最近的工作發(fā)現(xiàn)，濃度為10-12～10-9mol/L的AcSDKP能抑制小鼠和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，最大效應(yīng)濃度為10-11mol/L[7]．但AcSDKP抑制細(xì)胞增殖的作用機(jī)制目前尚不十分清楚，在本研究中，從細(xì)胞周期、細(xì)胞貼壁等方面進(jìn)行了初步探討．

BrdU摻入法是一種常用的細(xì)胞周期分析方法．傳代培養(yǎng)第3代的人骨髓MSC的BrdU摻入試驗(yàn)結(jié)果顯示，AcSDKP為10-11～10-9mol/L 范圍內(nèi)的各濃度組的S期細(xì)胞，與對(duì)照組比較顯著減少．這說(shuō)明了該濃度范圍內(nèi)的AcSDKP可以通過(guò)阻止人MSC進(jìn)入S期．FCM檢測(cè)了不同濃度AcSDKP培養(yǎng)條件下人骨髓MSC各時(shí)相細(xì)胞的百分率，結(jié)果顯示AcSDKP添加組的S+G2/M期細(xì)胞的比率降低，G0/G1期細(xì)胞明顯增加，進(jìn)一步表明AcSDKP能通過(guò)阻止人MSC進(jìn)入S期，使其停留在G0/G1期，且最大效應(yīng)濃度為10-11mol/L，與前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致[7]．這些結(jié)果與Jackson等[3,12]的報(bào)道AcSDKP對(duì)其他細(xì)胞的抑制作用相近．另外，由于AcSDKP是血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶(ACE)的一種生理底物，在該酶的作用下，AcSDKP降解失活．卡托普利是ACE抑制劑，預(yù)實(shí)驗(yàn)表明卡托普利對(duì)人骨髓MSC的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響．考慮到培養(yǎng)體系中血清成分含有ACE，貼壁細(xì)胞也能表達(dá)ACE，因此，在培養(yǎng)體系中加入AcSDKP的同時(shí)，也加入卡托普利，以維持AcSDKP在體系中的濃度．

Bonnet等[12]還報(bào)道，在人骨髓長(zhǎng)期培養(yǎng)中加入AcSDKP，非黏附貼壁層的造血祖細(xì)胞減少，停止加入AcSDKP后兩周，祖細(xì)胞數(shù)恢復(fù)到對(duì)照組水平．在本研究中作者也觀察到，AcSDKP在人骨髓MSC集落培養(yǎng)體系中作用一段時(shí)間后，通過(guò)換液撤除，MSC集落生成能夠在一定程度上得到恢復(fù)，說(shuō)明AcSDKP對(duì)MSC的增殖抑制作用也是可逆的，其作用停止后，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)，提示停滯在G0/G1期細(xì)胞重新進(jìn)入了S期．

Robinson 等[13]在AcSDKP與細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子共用于培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，AcSDKP不是直接對(duì)造血干/祖細(xì)胞起作用而影響它們?cè)赟期的數(shù)量和比例，而是阻斷細(xì)胞增殖刺激因子的作用，阻止靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期．在本研究中，MSC增殖所需要的生長(zhǎng)因子主要由FBS提供，作者在不同的FBS濃度的培養(yǎng)體系中加入了該因子，觀察MSC集落的變化．結(jié)果表明，F(xiàn)BS為10%、20%、30%的培養(yǎng)條件下，AcSDKP抑制MSC集落的生成，集落生成數(shù)顯著減少，但抑制率隨FBS的濃度升高而降低；而FBS濃度為40%時(shí)，AcSDKP對(duì)MSC集落生成無(wú)明顯影響．這些結(jié)果提示，AcSDKP阻遏細(xì)胞生長(zhǎng)刺激因子的作用，可能是其抑制MSC集落生成的機(jī)制之一．另外，AcSDKP還可能通過(guò)對(duì)抗促貼壁因子的作用，而抑制MSC的增殖．MSC的生存和生長(zhǎng)具有停泊依賴性，作者前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MSC在一般情況下培養(yǎng)24 h會(huì)有90%以上的細(xì)胞貼壁．本實(shí)驗(yàn)中，作者在培養(yǎng)MSC 24 h后，去除未貼壁細(xì)胞，用MTT檢測(cè)其貼壁的活力細(xì)胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)添加AcSDKP組的貼壁細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，提示AcSDKP影響了MSC的貼壁，但這種作用是因?yàn)橐种屏四z原等ECM(細(xì)胞外基質(zhì))分子及CAM(細(xì)胞黏附分子)的合成，還是對(duì)抗了血清中促貼壁因子的作用，都有待進(jìn)一步的研究證實(shí)．

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