馬紅梅， 莫美華， 張耀輝

(1.瓊州學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，中國 五指山 572200；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，中國 廣州 510642)

化感作用(Allelopathy)是指植物或微生物的分泌物對環(huán)境中其他植物或微生物的有利或不利的作用[1]．近年來，微生物化感作用的研究取得了很大進(jìn)展．國外已成功地從微生物代謝產(chǎn)物中開發(fā)出草丁膦[2]、除草素A,B[3]、莠去津[4]、二苯醚類[5]等商品除草劑，這些研究多數(shù)局限于病原真菌和土壤根際微生物．莫美華等人在采集紅汁乳菇時(shí)，發(fā)現(xiàn)紅汁乳菇周圍有特殊的蘑菇圈現(xiàn)象，其周圍少見雙子葉和其他單子葉的草本植物，對它的野生子實(shí)體研究發(fā)現(xiàn)子實(shí)體醇提物具有很強(qiáng)的化感作用[6-7]．然而擔(dān)子菌的子實(shí)體是由真菌的營養(yǎng)菌絲和生殖菌絲纏結(jié)而成的，由此讓人聯(lián)想到擔(dān)子菌的菌絲也可能具有化感作用．本實(shí)驗(yàn)用紅汁乳菇菌絲體的醇提物對稗草和水稻進(jìn)行了化感作用的研究，并通過GC-MS聯(lián)用分析，初步鑒定菌絲體醇提物中化感作用的物質(zhì)，為紅汁乳菇菌絲體進(jìn)一步開發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 材料

紅汁乳菇菌絲體由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物教研室提供.

1.2 紅汁乳菇菌絲體的無水乙醇抽提液制備

紅汁乳菇菌絲體研磨成粉后按1∶30的質(zhì)量比與無水乙醇混合，于80 ℃回流抽提10 h，抽提液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60 ℃下濃縮至不再有溶劑后稱重，配成7，3.5，1.75，0.875 g/L不同濃度，每個(gè)濃度做4次重復(fù)．

1.3 生物測定

在90 mm培養(yǎng)皿內(nèi)放入一張濾紙，濕熱滅菌后每個(gè)培養(yǎng)皿中各加5 mL上述不同濃度的處理液，每個(gè)濃度做4個(gè)重復(fù)．選20粒均勻飽滿的受體種子置培養(yǎng)皿中，蓋上培養(yǎng)皿蓋，放入設(shè)置溫度為25 ℃，濕度為80%～90%的人工氣候箱中培養(yǎng)7d，每天光照10 h左右，7 d后測量稗草和水稻幼苗的根長及苗高．按照Wiliamson提供的方法計(jì)算化感作用效應(yīng)指數(shù)(Response Indices，RI)[8]．

其中，C為對照值，T為處理值．當(dāng)RI>0時(shí)為促進(jìn)作用，RI<0為抑制作用，RI絕對值大小與作用強(qiáng)度一致．用鄧肯氏新復(fù)極差檢驗(yàn)法(DMRT法)檢驗(yàn)不同處理的差異顯著性(α=0.05).

1.4 紅汁乳菇菌絲體無水乙醇粗提物的GC-MS分析

采用DB-5柱(30 m×0.32 mm)色譜柱．柱子的初始溫度為50 ℃，保留2 min，采用程序升溫，升溫速率為5 ℃/min，升至250 ℃，保留10 min后，繼續(xù)以速率5 ℃/min升溫至270 ℃，保留10 min．進(jìn)樣口的溫度：240 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；載氣為He；流量：1 mL/min．電子轟擊源，轟擊電壓為70 eV，掃描范圍M/Z35～350 AMU，掃描速度0.2 s掃全程，離子源溫度200 ℃．通過計(jì)算機(jī)檢索系統(tǒng)，進(jìn)行未知物的鑒定．

2 結(jié)果與分析

2.1 紅汁乳菇菌絲體無水乙醇抽提物對稗草、水稻幼苗生長的影響

用無水乙醇抽提紅汁乳菇菌絲體，抽提液配成0.875，1.75，3.5，7 g/L不同質(zhì)量濃度后，抽提液由淡黃色逐漸變棕黃色,同時(shí)測定抽提液對稗草、水稻幼苗生長的影響．結(jié)果顯示(見表1)：不同質(zhì)量濃度的無水乙醇菌絲抽提液對稗草和水稻幼苗的生長均有一定程度的影響，且對稗草幼苗生長的影響比對水稻幼苗生長的影響大；隨著質(zhì)量濃度的增加，抽提液對稗草和水稻的幼苗生長的抑制作用也加強(qiáng)．質(zhì)量濃度為0.875 g/L時(shí)，對稗草苗高和根長的抑制作用分別為-0.019 3、-0.078 4，在P=0.05水平上與對照差異不顯著．質(zhì)量濃度為1.75 g/L時(shí)，抽提液對稗草苗高和根長的抑制作用分別是-0.233 5、-0.355 4，與對照相比差異顯著；對水稻幼苗的苗高和根長的促進(jìn)作用達(dá)到最大，化感效應(yīng)分別為0.308 1、0.306 3, 在P=0.05水平上與對照差異顯著; 質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí)，對稗草和水稻的抑制作用均達(dá)到最大，對稗草苗高和根長的化感效應(yīng)分別為-0.787 7和-0.711 3；對水稻苗高和根長的化感效應(yīng)分別為-0.414 7和-0.498 6．

這一結(jié)果說明，紅汁乳菇菌絲體乙醇抽提液對稗草有很強(qiáng)的抑制作用，且隨著質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)；而對水稻表現(xiàn)出低質(zhì)量濃度促進(jìn)，高質(zhì)量濃度抑制的效果．

表1 菌絲體抽提液對稗草、水稻幼苗生長的影響

注：RI為同一處理4次重復(fù)化感作用效應(yīng)的平均值；表內(nèi)標(biāo)相同小寫字母者,表示Duncan’s新復(fù)極差檢驗(yàn)在P=0.05水平上,差異不顯著.

2.2 紅汁乳菇菌絲體無水乙醇抽提物的GC-MS鑒定

紅汁乳菇菌絲體的無水乙醇抽提液樣品的GC-MS總離子流圖TIC見圖1，應(yīng)用HPCHEM質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，分析質(zhì)譜圖，確定各組分物質(zhì)名稱，其鑒定結(jié)果見表2．

表中所列出的化合物均屬GC-MS鑒定在附和系數(shù)超過50%以上的化合物，不包括更多的含量低的未被鑒定出的化合物．對于那些弱峰，GC-MS鑒定出的化合物的可信度低，沒有列入表2中．

圖1 菌絲抽提液的GC-MS總離子流TIC圖

化合物名稱(中文)化合物名稱(英文)壬酸Nonanoic acid十八烷酸Octadecanoic acid十四烷酸Tetradecanoic acid雙(2-甲基丙基)酯-1,2-鄰苯二甲酸1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis(2-methylpropyl) estern-十六烷酸n-Hexadecanoic acid2-十四烷酮2-Tetradecanone6,10,14-三甲基-2-十五烷酮2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl-十六烷酸甲酯Hexadecanoic acid, methyl ester鄰苯二甲酸二丁酯Dibutyl phthalate1,2-鄰苯二甲酸二丁酯1,2-Benzenedicarboxylic acid, dibutyl ester十六烷酸乙酯Hexadecanoic acid, ethyl ester十八烷酸乙酯Octadecanoic acid, ethyl ester3,7,11,15-四甲基[R-[R*,R*-(E)]] 2-十六烷烯-1-醇2-hexadecene-1-oL,3,7,11,15-tetramethyl-, [R-[R*,R*-(E)]]-3-(1',3'-丁間二烯基)-吲哚3-(1',3'-Buta-dienyl)-indole

由GC-MS測定分析結(jié)果顯示：紅汁乳菇菌絲體無水乙醇抽提液中含有低分子量的脂肪酸、有機(jī)酸、酮、酯、醇、吲哚、烴、酚類等化合物，其中有一些物質(zhì)屬于陳秋波和韓麗梅等人歸納的具有化感作用的物質(zhì)[9-10]，如菌絲中含有的吲哚類衍生物——3-(1′,3′-丁間二烯基)-吲哚、鄰苯二甲酸、鄰苯二甲酸二丁酯，苯酚類化合物等．

3 結(jié)果與討論

紅汁乳菇菌絲體無水乙醇抽提液對稗草抑制作用較大，且隨著質(zhì)量濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)．當(dāng)質(zhì)量濃度為7 g/L時(shí)，對稗草的苗長和根長的抑制作用分別達(dá)到78.77%和71.13%；而對水稻表現(xiàn)出低質(zhì)量濃度促進(jìn)根的生長，高質(zhì)量濃度抑制幼苗生長的效果．當(dāng)質(zhì)量濃度為1.75 g/L時(shí)，粗提物對水稻苗高和根長的促進(jìn)作用分別為0.308 1和0.306 3，而在此質(zhì)量濃度下，對稗草的抑制作用明顯，因此可利用此特性，將菌絲體無水乙醇粗提物開發(fā)成稻田除草劑．

菌絲中含有的鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸二丁酯，曾被報(bào)導(dǎo)具有很強(qiáng)的化感作用．周志紅等人研究番茄植株中幾種化學(xué)成分的化感作用，結(jié)果顯示：從番茄植物中提取的鄰苯二甲酸二丁酯對生菜、白菜和蘿卜均有抑制作用[11]．韓麗梅等人(2003)研究大豆根分泌物對大豆幼苗生長的影響，結(jié)果也表明:在一定濃度范圍內(nèi), 鄰苯二甲酸對大豆幼苗生長具有顯著的化感抑制作用[12]．從報(bào)道來看，紅汁乳菇菌絲體乙醇抽提物的化感作用很有可能由鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸二丁酯等有機(jī)酸類化感物質(zhì)產(chǎn)生的．

參考文獻(xiàn)：

[1] RICE E L. Allelopathy[M]. New York: Academic Press, 1974.

[2] CUTLER H G. Biologically active natural products from fungi:Templates for tomorrow’s pesticides[J]. American Chemical Society Ser, 1984, 257:153-170.

[3] DUKE S O. Microbically produced phytotoxins as herbicides a perspective[C]// PUTNAM A R, TANG C S. The Science of Allelopathy. New York: John Wiley & Sons, 1986, 287-304.

[4] SEGULA M. Isolation and characterization of a novel atrazine metabolite produced by the fungus[J]. Pulmonarius of Applied and Environmental Microbiology, 1993, 59(12):4 342-4 346.

[5] VENKATASUBBAIAH P. Phytotoxic metabolites of phomasorghina[J]. Mycologia, 1995, 84:715.

[6] 莫美華, 馬紅梅, 肖啟福, 等. 紅汁乳菇醇提物對水稻、稗草的化感影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2004，24(12)：2 951-2 954.

[7] LIU J C, CHEN X Y, LI W Y. Study of the distribution and ecological environment of Lacterius hatsudake Tanaka in west Hunan[J]. Edible Fungi of China, 1995,14(6):36-37.

[8] WILLAMSON G B. Bioassays for allelopathy: measuring treatment responses with independent control[J]. J of Chem Ecol, 1988,14(1): 181-187.

[9] 陳秋波， 彭黎旭， 賀利民， 等. 剛果12號桉樹根及根際土壤中化感物質(zhì)的成分分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，22(4)：28-34.

[10] 韓麗梅， 閻 飛， 王樹起， 等. 重迎茬大豆根際土壤有機(jī)化合物的初步鑒定及對大豆種子萌發(fā)的化感作用[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2000，11(4)：582-586.

[11] 周志紅, 駱世明, 牟子平. 番茄植株中幾種化學(xué)成分的化感效應(yīng)[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1998,19(3): 56-60.

[12] 韓麗梅, 王樹起, 鞠會(huì)艷，等. 吸附樹脂提取的大豆根分泌物種類的GC-MS[J]. 大豆科學(xué), 2003,22(4): 302-305.