TNF-α基因多態(tài)性與2型糖尿病患者輕度認(rèn)知功能障礙的相關(guān)性

沈芳芳 謝 云 趙 霞 孟憲海 汪瑋琳 韓麗萍 齊秀英

隨著對(duì)糖尿病研究的逐步深入，很多學(xué)者認(rèn)為糖尿病與認(rèn)知障礙之間有明顯的相關(guān)性，它是誘發(fā)Alzheimer病（Alzheimer’s disease，AD）的一個(gè)危險(xiǎn)因素[1]。因此，對(duì)糖尿病患者認(rèn)知功能障礙的易感因素，尤其遺傳易感性研究對(duì)篩選出AD的高危人群及預(yù)防和延遲T2DM患者認(rèn)知減退具有重要意義。為探討TNF-α基因多態(tài)性與T2DM合并輕度認(rèn)知功能障礙（MCI）的關(guān)系，本研究分析TNF-α2等位基因在T2DM合并MCI發(fā)病中的作用，及T2DM合并MCI的相關(guān)危險(xiǎn)因素。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2008年5月—2009年1月在天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院住院的198例2型糖尿病患者作為調(diào)查疾病史；癲；影響認(rèn)知功能測(cè)試的其他嚴(yán)重軀體疾病。

1.2 方法

1.2.1 采集資料 分別采集研究對(duì)象的性別、年齡、家族史、病程、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HBA1c）、糖尿病并發(fā)癥以及是否使用胰島素治療等項(xiàng)目，并計(jì)算體質(zhì)量指數(shù)（BMI）。

1.2.2 檢測(cè)TNF-α-308A/G基因多態(tài)性 應(yīng)用PCR-RFLP法進(jìn)行檢測(cè)。（1）模板DNA提取:抽取空腹肘正中靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝，利用血液基因組DNA抽提試劑盒（大連TaKaRa公司）提取外周血白細(xì)胞DNA。（2）PCR擴(kuò)增：上游引物為 5′－AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT－3′，下游引物為 5′－TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG－3′。PCR 條件為 94℃5 min預(yù)變性，35個(gè)循環(huán)（94℃1 min變性，59℃45 s退火，72℃6O s延伸），72℃5 min終末延伸；擴(kuò)增產(chǎn)物為107 bp。（3）PCR產(chǎn)物以限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ在37℃酶切1 h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察基因型結(jié)果。（4）序列分析：由天根生化科技（北京）有限公司進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有分析應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包完成。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率或構(gòu)成比表示，組間的比較采用χ2檢驗(yàn)。等位基因頻率、基因型頻率的分析采用χ2檢驗(yàn)。T2DM合并MCI危險(xiǎn)因素的分析采用非條件Logistic回歸分析。對(duì)象。2型糖尿病的診斷根據(jù)1999年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用簡(jiǎn)易智能精神狀態(tài)檢查量表（MMSE）、畫(huà)鐘測(cè)驗(yàn)（CDT），對(duì)每位受檢者的認(rèn)知功能進(jìn)行綜合評(píng)定：MMSE包括定向力、記憶力、注意力和計(jì)算力、回憶能力、語(yǔ)言能力5個(gè)方面的檢查，滿分為30分；CDT采用國(guó)際上普遍采用4分法計(jì)分。依據(jù)《2006年中國(guó)防治認(rèn)知功能障礙專家共識(shí)》：23分＜MMSE＜27分，CDT 0～2分的調(diào)查者診斷為MCI。調(diào)查對(duì)象中的40例MCI患者作為T2DM MCI組，從認(rèn)知功能正常組中隨機(jī)抽取80例患者作為T2DM非MCI組。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重低血糖以及糖尿病酮癥酸中毒等昏迷史；退行性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森病、Down綜合征等；在3個(gè)月內(nèi)有急性腦血管

2 結(jié)果

2.1 MCI組和非MCI組臨床及生化指標(biāo)比較 2型糖尿病患者M(jìn)CI組與非MCI組的年齡、病程、DM家族史、BMI、P2BG、HbA1c、DM 視網(wǎng)膜病變、DM 周圍神經(jīng)病變、高血壓比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或 P＜0.01），性別、FBG、總膽固醇、DM 腎病、冠心病以及胰島素治療的差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

2.2 TNF-α-308A/G基因多態(tài)性分析 TNF-α基因在-308位點(diǎn)為G時(shí)定義為TNF-α1，為A時(shí)定義為TNF-α2。TNF-α PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶NcoⅠ酶切后，TNF-α-308AA基因型電泳可見(jiàn)：107 bp 1條帶；TNF-α-308 GG基因型電泳可見(jiàn)：87 bp和20 bp 2條帶；TNF-α-308 GA基因型電泳可見(jiàn)：107 bp、87 bp和 20 bp 3條帶，見(jiàn)圖1。2組 TNF-α-308A/G基因型及等位基因的分布差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），見(jiàn)表2。

表1 2型糖尿病患者M(jìn)CI組和非MCI組臨床及生化指標(biāo)比較 （±s或構(gòu)成比）

表1 2型糖尿病患者M(jìn)CI組和非MCI組臨床及生化指標(biāo)比較 （±s或構(gòu)成比）

*P＜0.05，**P＜0.01；表2 同

組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80性別（男/女）15/25 36/44 0.61年齡（歲）68.70±7.21 61.09±6.70 5.72**病程（a）14.03±8.54 8.79±6.05 3.87**DM家族史（例）13 47 7.35**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80 BMI（kg/m2）25.09±2.86 26.28±3.27 1.96*FBG(mmol/L)10.42±1.79 10.57±3.47 0.30 P2BG(mmol/L)15.33±2.19 13.47±3.72 3.31**HbA1c 0.095±0.022 0.085±0.022 2.41*組別 n MCI組非MCI組t或 χ2 40 80總膽固醇（mmol/L）5.81±1.35 5.34±1.38 1.78 DM腎病例（%）18（45）36（45）0.00 DM視網(wǎng)膜病變 例（%）26（65）32（40）6.67*DM周圍神經(jīng)病變 例（%）31（76）41（51）7.66**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80高血壓例（%）31（76）42（52）7.00**冠心病例（%）24（60）59（74）2.36胰島素治療例（%）27（68）64（80）2.27

圖1 TNF-α基因PCR產(chǎn)物限制性酶切電泳圖

表2 TNF-α-308A/G基因多態(tài)性分布

2.3 非條件Logistic回歸分析 將MCI組和非MCI組臨床及生化指標(biāo)中差別有統(tǒng)計(jì)意義的9項(xiàng)指標(biāo)和TNF-α基因型作為自變量，以T2DM是否合并MCI作為因變量，進(jìn)行非條件Logistic回歸。結(jié)果表明，TNF-α、糖尿病周圍神經(jīng)病變、視網(wǎng)膜病變、年齡、餐后2 h血糖是T2DM合并MCI的危險(xiǎn)因素，見(jiàn)表3。

表3 非條件Logistic回歸分析

3 討論

目前醫(yī)學(xué)界公認(rèn)的MCI指介于正常老化和癡呆之間的一種認(rèn)知缺損狀態(tài)，主要表現(xiàn)在記憶減退與年齡的不相稱，但沒(méi)有達(dá)到AD的標(biāo)準(zhǔn)。Logroscino等[2]通過(guò)大人群前瞻性研究發(fā)現(xiàn)，老年T2DM患者基線認(rèn)知功能測(cè)試的得分低于非糖尿病者，并且在2～6年的隨訪過(guò)程中其認(rèn)知功能下降的危險(xiǎn)性增加。

糖尿病患者慢性高血糖及其慢性代謝異常可造成腦血管損害和神經(jīng)元變性。有研究表明，高血壓、糖尿病、高膽固醇和腦白質(zhì)變性及腦梗死與MCI有關(guān)，提示血管危險(xiǎn)因素可能是MCI的重要原因[3]。Akisaki等[4]研究發(fā)現(xiàn)，T2DM患者的認(rèn)知功能障礙主要與糖尿病微血管并發(fā)癥有關(guān)，與本文調(diào)查結(jié)果相似。本研究顯示MCI與糖尿病視網(wǎng)膜病變和周圍神經(jīng)病變有關(guān)，后者均為糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥；未見(jiàn)糖尿病腎病在2組之間有差別，可能與例數(shù)較少有關(guān)。國(guó)外研究表明，高血糖時(shí)醛糖還原酶活性顯著增高，使葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨醇增加，可引起神經(jīng)細(xì)胞高滲和水腫[5]。此外，高血糖時(shí)tau蛋白和 β 淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）發(fā)生非酶糖基化，形成糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），后者通過(guò)受體途徑刺激免疫應(yīng)答反應(yīng)或直接作用產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞功能障礙甚至死亡。

人TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)域-308位點(diǎn)存在G/A多態(tài)性并與TNF-α的表達(dá)水平有關(guān)。與TNF-α1等位基因比較，TNF-α2基因使TNF-α表達(dá)增加，TNF-α的濃度也增加[6]。在AD及MCI患者的大腦、腦脊液及外周血中發(fā)現(xiàn)TNF-α的升高。Culpan等[7]發(fā)現(xiàn)AD患者TNF-α2等位基因頻率異常增高，而且攜帶TNF-α2等位基因者發(fā)病年齡較早。目前大多學(xué)者認(rèn)為TNF-α基因多態(tài)性增加了AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[8]。Bermejo等[9]研究表明AD腦內(nèi)炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，活化的炎性細(xì)胞和大量炎性細(xì)胞因子（主要包括IL和TNF）通過(guò)一系列信號(hào)傳導(dǎo)通路促使Aβ沉積以及老年斑和神經(jīng)纖維纏結(jié)的形成，造成神經(jīng)元的損傷和死亡。

本研究結(jié)果顯示，TNF-α與DM合并MCI的遺傳易感性相關(guān)，推斷TNF-α2等位基因是DM罹患MCI的危險(xiǎn)因素。但DM合并MCI的發(fā)生為多因素參與，且TNF-α基因多態(tài)性在不同人種、地區(qū)的差異及與其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚。本研究例數(shù)有限，需進(jìn)一步深入研究。同時(shí)，強(qiáng)調(diào)早期、有效地治療DM患者的血糖、并發(fā)癥等可能是防止MCI發(fā)生的有效措施，對(duì)預(yù)防癡呆可能起到一定的作用。

[1]Kalaria RN.Neurodegenerative disease:Diabetes,microvascular pathology and Alzheimer disease[J].Arch Neurol,2009,66(3):315-322.

[2]Logroscino G,Kang JH，Grodstein F.Prospective study of type 2 diabetes and cognitive decline in women aged 70-81 years[J].BMJ，2004,328（7439）：548.

[3]Roberts RO,Geda YE,Knopman DS，et al.Association of duration and severity of diabetes mellitus with mild cognitive impairment[J].Arch Neurol,2008,65(8):1066-1073.

[4]Akisaki T,Sakurai T,Takata T,et al.Cognitive dysfunction associates with white matter hyperintensities and subcortical atrophy on magnetic resonance imaging of the elderly diabetes mellitus Japanese elderly diabetes intervention trial(J-EDIT)[J].Diabetes Metab Res Rev,2006,22(5):376-384.

[5]Pavlovi? DM,Pavlovi? AM.Dementia and diabetes mellitus[J].Srp Arh Celok Lek,2008,136(3-4):170-175.

[6]Elahi MM,Asotra K,Matata BM,et al.Tumor necrosis factor alpha-308 gene locus promoter polymorphism:an analysis of association with health and disease[J].Biochim Biophys Acta,2009,1792(3):163-172.

[7]Culpan D,MacGowan SH,Ford JM，et al.Tumor necrosis factor alpha gene polymorphisms and Alzheimer’s disease[J].Neurosci Lett,2003,350(1):61-65.

[8]Tan ZS,Beiser AS,Vasan RS,et al.Inflammatory markers and the risk of Alzheimers’disease[J].Neurology,2007,68(22):1902-1908.

[9]Bermejo P,Martín-Aragón S,Benedí J,et al.Differences of peripheral inflammatory markers between mild cognitive impairment and Alzheimer’s disease[J].Immunol Lett,2008,117(2):198-202.