郭曉強 高姍姍 丁 卉 段相林

(河北師范大學生命科學學院 河北省動物生理生化與分子生物學重點實驗室,河北 石家莊 050016)

鐵是生物發(fā)育所必需的元素之一,參與物質(zhì)代謝、紅細胞生成和細胞分裂等多重生物學功能〔1〕,它的缺乏是貧血發(fā)生的重要原因。然而,鐵還參與了導致機體損傷的活性氧物質(zhì)生成,隨著年齡增長組織出現(xiàn)的鐵沉積可造成機體衰老和多種退行性疾病的發(fā)生〔2〕,因此維持機體內(nèi)穩(wěn)態(tài)尤其是高鐵狀態(tài)下抑制鐵吸收具有十分重要的意義〔3〕。維生素 C可促進鐵的吸收,是補鐵常用輔助品之一,然而維生素 C作為老年人提倡補充的化合物是否可減少鐵沉積尚缺乏實驗證據(jù)。食物中的三價鐵主要是在十二指腸被吸收,首先把三價鐵還原為二價鐵,然后再與二價金屬轉(zhuǎn)運蛋白 1(divalentmetal transporter 1,DMT1)結(jié)合并轉(zhuǎn)運至吸收細胞內(nèi),進入吸收細胞內(nèi)的鐵除了滿足吸收細胞本身需要外,其余的鐵由鐵轉(zhuǎn)運蛋白 (ferroportin,FPN)釋放出吸收細胞并進入血循環(huán),經(jīng)血循環(huán)供機體各器官組織應用〔4〕。本實驗研究以成年小鼠為材料,探索維生素 C對十二指腸攜帶鐵應答元件 (iron-responsive element,IRE)的 DMT1(DMT1+I RE)和 FPN的 mRNA表達影響。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 實驗用 3月齡昆明小鼠 (清潔級)購自河北省實驗動物中心,體重 35 g左右;Trizol試劑盒、苜?；ㄈ~病毒 (AMV)逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq酶、維生素 C和焦碳酸二乙酯 (DEPC)等均購自上海生工,其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和處理 15只小鼠分為 3組,分別用正常鐵飼料 (含 0.5 g/kg乳酸亞鐵)、高鐵飼料 (含 2g/kg乳酸亞鐵)和高鐵飼料加維生素 C(含 2 g/kg乳酸亞鐵和 0.8 g/kg的維生素 C)喂養(yǎng) 1 w(正常飲水),飼料其他成分均相同。

1.2.2 取材 取材前 12 h禁食以減少小鼠肝糖原積累。腹腔注射 0.4%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后剖開腹腔,心臟取血以制備血清測定血清鐵和總鐵結(jié)合力,使用 DEPC處理的生理鹽水心臟灌流,完畢后取適量十二指腸放入 Trizol中供 RNA提取。

1.2.3 小鼠血清鐵和總鐵結(jié)合力測定 使用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的試劑盒按照說明書完成,然后計算轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度 (血清鐵 /總鐵結(jié)合力)。

1.2.4 小鼠十二指腸 DMT1+ IRE和 FPN的 mRNA半定量RT-PCR檢測 十二指腸黏膜首先進行總 RNA提取和濃度測定,取相同量總 RNA應用逆轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA后對 DMT1+IRE、FPN和肌動蛋白 (β-actin)進行 PCR擴增 34個循環(huán) (94℃變性30 s,58℃退火 40 s,72℃延伸 1 min),將 PCR產(chǎn)物用 1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離,所得結(jié)果用凝膠成像系統(tǒng)掃描并計算吸光度值。實驗中所用基因的 PCR引物均為上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成,其序列分別為：DMT1+IRE：正義鏈為 TCCTGGACTGTGGACGCT;反義鏈為 GGTGTTCAGAAGATAGAGTTCAGG;FPN：正義鏈為 ACAAACAAGGGGAGAACGC;反義鏈為ATGACGGACACATTCTGAACCA;β-actin：正義鏈為 AGCCATGTACGTAGCCATCC;反義鏈為 TTTGAGGTCACGCACGATTT。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)以 x ±s表示,應用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 維生素 C對高鐵飲食增加小鼠 DMT1+IRE和 FPN mRNA表達的抑制作用 半定量 RT-PCR檢測表明,高鐵飲食相對于正常鐵喂養(yǎng)明顯增加了小鼠DMT1+IRE和 FPN的mRNA表達 (P＜0.05),在添加維生素 C后,這種增加效應明顯受到抑制 (P＜0.05)。見圖1。

圖1 維生素對高鐵狀況下腸鐵吸收蛋白基因表達的影響

2.2 維生素 C對高鐵飲食血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度的影響相對于正常鐵飲食,高鐵飼養(yǎng)可顯著升高小鼠血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度 (P＜0.05),而添加維生素 C后可顯著減少高鐵飲食引起的血清鐵和轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度升高 (P＜0.05)。見表1。

表1 維生素 C對高鐵飲食小鼠血清鐵和總鐵結(jié)合力的影響

表1 維生素 C對高鐵飲食小鼠血清鐵和總鐵結(jié)合力的影響

與正常組比較：1)P＜0.05;與高鐵組比較：2)P＜0.05;下圖同

指標 正常鐵 高鐵 高鐵 +維生素 C血清鐵 (μg/dl) 1.41±0.26 2.15±0.481) 1.71±0.282)轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度(%) 59.2±6.3 78.2±6.71) 66.4±7.22)

3 討 論

已知,缺鐵情況下維生素 C可促進鐵吸收,因此常用作補鐵輔助藥物〔5〕,然而研究還發(fā)現(xiàn)維生素 C擁有減少高鐵誘發(fā)的氧化損傷作用〔6〕,這種作用可能有兩種機制,一種是作為抗氧化試劑的維生素 C通過還原作用來實現(xiàn)〔7〕,另一種是維生素 C本身調(diào)節(jié)鐵代謝相關(guān)基因的表達以減少鐵吸收〔8〕。本研究表明,高鐵飼料可促進小鼠十二指腸 DMT1+I RE和轉(zhuǎn)鐵蛋白的表達,從而增加了鐵的攝入,因此機體血清鐵和 FPN飽和度增加,機體損傷增多,如高鐵飲食小鼠常表現(xiàn)出發(fā)育遲緩,反應力下降甚至死亡等。在高鐵飼料中補充維生素 C后,高鐵引起的DMT1+IRE和 FPN的 mRNA表達升高效應明顯受到抑制,從而鐵吸收減少,血清鐵降低,這說明高鐵狀態(tài)下維生素 C可通過抑制腸鐵吸收而保護機體免受損傷。

最近發(fā)現(xiàn)低氧誘導因子-2α(hypoxia inducible factors-2α,H IF-2α)在腸鐵吸收過程中發(fā)揮了重要作用〔9〕。低鐵狀態(tài)下,H IF-2α可促進 DMT1+IRE和 FPN的基因表達以增加鐵的吸收,而鐵過載引起 H IF-2α泛素化修飾并被蛋白酶體降解,DMT1和 FPN表達減少而抑制鐵吸收〔10〕。H IF-2α泛素化修飾前需要首先羥基化,該過程有多種輔助因子的參與,如低氧、高鐵、α-酮戊二酸及維生素 C等〔11〕,因此高鐵狀態(tài)下維生素 C的存在有利于 H IF-2α最終降解和 DMT1的表達抑制,減少鐵吸收從而更好的維持機體鐵穩(wěn)態(tài)。

本實驗初步闡明了維生素 C在高鐵狀態(tài)下對腸鐵吸收的抑制作用,一方面有利于對鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)機制的理解,另一方面在將來對緩解老年人鐵過載引起的機體損傷方面也有重要裨益。

1 Andrews NC.Forging a field：the golden age of iron biology〔J〕.Blood,2008;112(2)：219-30.

2 Xu J,Knutson MD,Carter CS,et al.Iron accumulation with age,oxidative stress and functional decline〔J〕.P Los One,2008;3(8)：2865.

3 Hentze MW,muckenthaler MU,Andrews NC.Balancing acts：molecular control of mammalian iron metabolism〔J〕.Cell,2004;117(3)：285-97.

4 Anderson GJ,Frazer DM,McLaren GD.Iron absorption and metabolism〔J〕.Curr Opin Gastroenterol,2009;25(2)：129-35.

5 Péneau S,Dauchet L,Vergnaud AC,et al.Relationship between iron status and dietary fruit and vegetables based on their vitamin C and fiber content〔J〕.Am J Clin Nutr,2008;87(5)：1298-305.

6 Duarte TL,Jones GD.Vitamin C modulation of H2O2-induced damage and iron homeostasis in human cells〔J〕.Free Radic Biol Med,2007;43(8)：1165-75.

7 Rehman A,Collis CS,YangM,et al.The effectsof iron and vitamin C cosupplementation on oxidative damage to DNA in healthy volunteers〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,1998;246(1)：293-8.

8 Kang JS,Cho D,Kim YI,et al.Sodium ascorbate(vitamin C)induces apoptosis inmelanoma cells via the down-regulation of transferrin receptor dependent iron uptake〔J〕.J Cell Physiol,2005;204(1)：192-7.

9 郭曉強,高姍姍,李 會,等 .缺氧誘導因子-2α與腸鐵吸收〔J〕.生命的化學,2009;29(6)：893-7.

10 Mastrogiannaki M,Matak P,Keith B,et al.HIF-2 alpha,but not HIF-1alpha,promotes iron absorption in mice〔J〕.J Clin Invest,2009;119(5)：1159-66.

11 Kaelin WG Jr.The von Hippel-Lindau tumour suppressor protein：O2sensing and cancer〔J〕.Nat Rev Cancer,2008;8(11)：865-73.