伊艷杰，周廣舟，時 玉，李瑞芳，陳曉娣

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件

伊艷杰，周廣舟，時 玉，李瑞芳，陳曉娣

（河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001）

熒光假單胞菌RB5是從土壤中分離得到的一株對禾谷絲核菌有拮抗作用的細(xì)菌.通過CAS法檢測分析，發(fā)現(xiàn)RB5菌株能產(chǎn)生嗜鐵素.為明確熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件，采用搖瓶培養(yǎng)發(fā)酵，利用特異光譜吸收法，研究了不同培養(yǎng)條件對RB5菌株嗜鐵素產(chǎn)量的影響.最終得出RB5產(chǎn)嗜鐵素的最佳發(fā)酵條件：起始pH 7.0，接種量2%，瓶裝量90 mL/250 mL，發(fā)酵時間48 h，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0.8 mg/L.抑菌試驗表明，優(yōu)化發(fā)酵條件后的RB5發(fā)酵液（OD400值2.35）有很顯著的抑菌效果，抑制率達(dá)65.28%.

熒光假單胞菌；嗜鐵素；發(fā)酵條件；抑菌效果

0 前言

熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）廣泛存在于土壤中，是植物根際的優(yōu)勢細(xì)菌種群，此類細(xì)菌的多數(shù)株系具有拮抗或促生作用[1].研究表明，熒光假單胞菌可產(chǎn)生嗜鐵素（siderophore）等多種有抗菌作用的次生代謝產(chǎn)物[2].嗜鐵素，又名鐵載體，是一類由微生物在低鐵條件下合成的小相對分子質(zhì)量的、能特異地螯合Fe3+的一種螯合因子[3].目前，嗜鐵素已被逐漸應(yīng)用到植物病原菌的防治中.大量研究結(jié)果認(rèn)為，嗜鐵素主要是通過對鐵離子的競爭影響病原菌的生長.熒光假單胞菌產(chǎn)生的嗜鐵素絡(luò)合根周圍鐵離子，使病菌得不到足夠的鐵營養(yǎng)，生長發(fā)育受到抑制，對植物體的危害減輕，因而植物生長發(fā)育得到改善.在小麥全蝕病、亞麻枯萎病的生物防治中，都是通過這一機制起作用[4].Ran等[5]通過平板拮抗活性測定表明，假單胞桿菌分泌的嗜鐵素是控制桉樹灰霉病的重要因子[5].因此，嗜鐵素被認(rèn)為是一種有開發(fā)和利用價值的新型生物活性物質(zhì).

探索嗜鐵素產(chǎn)生的最佳發(fā)酵條件，將有利于提高生防菌的效價，提高防效.此外，還可為嗜鐵素的進(jìn)一步分離、純化及理化性質(zhì)的研究奠定基礎(chǔ)，同時也為其后續(xù)的開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)支持[6].梁建根等[6]采用搖瓶發(fā)酵法，通過CAS檢測分析，對影響惡臭假單胞菌株HZ-2嗜鐵素分泌的幾種發(fā)酵因子進(jìn)行了研究.余賢美等[7]研究了不同培養(yǎng)條件對枯草芽孢桿菌Bs-15嗜鐵素產(chǎn)量的影響，得出了可獲得較高產(chǎn)量嗜鐵素的最佳發(fā)酵條件.王偉等[8]在搖瓶發(fā)酵條件下，研究了熒光假單胞菌SE-6在各種培養(yǎng)條件下的鐵載體分泌量，確定了適合鐵載體分泌的最佳培養(yǎng)條件：起始pH 6.5，裝瓶量20mL/500mL，接種量2%，最佳培養(yǎng)時間為46 h左右，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0.8mg/L.在此條件下，鐵載體在發(fā)酵液中含量最高，為大規(guī)模的發(fā)酵提供了有價值的數(shù)據(jù).基于前人的研究，本試驗選取影響發(fā)酵條件的幾個主要因素進(jìn)行研究，首次將不同處理得出的最佳發(fā)酵影響因素綜合起來進(jìn)行發(fā)酵，探討嗜鐵素的產(chǎn)量和熒光假單胞菌抑菌活性的關(guān)系.

本試驗所用的熒光假單胞菌RB5是作者從土壤中分離得到的，對小麥紋枯病的致病菌——禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）及其他多種植物病原菌均有較強的抑制作用.開展對熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素發(fā)酵條件的研究，將為該細(xì)菌的進(jìn)一步利用和微生物殺菌劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌種

產(chǎn)嗜鐵素細(xì)菌：熒光假單胞菌RB5（本實驗室分離保存菌種）.

小麥紋枯病菌：禾谷絲核菌（本實驗室保存菌種）.

1.2 試劑和儀器

鉻天青（CAS）：天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；8-羥基喹啉：天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心；UV—1100型紫外可見分光光度計：重慶奧特光學(xué)儀器；THZ—321恒溫振蕩搖床：上海精宏實驗設(shè)備有限公司；DHP—9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海圣欣科學(xué)儀器有限公司.

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 CAS檢測培養(yǎng)基

1 mmol/L CAS，4 mmol/L HDTMA，0.1 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH6.8.

1.3.2 液體種子培養(yǎng)基（1 L）

Kings'B培養(yǎng)基：甘油15mL，蛋白胨20 g，K2HPO40.3 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，pH7.0.

1.3.3 固體種子培養(yǎng)基（1 L）

在Kings'B培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加20 g瓊脂.

1.3.4 發(fā)酵標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基（1 L）

甘油1.5 g，水解酪蛋白1.0 g，硫酸鎂2.5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，8-羥基喹啉，pH 7.0.

1.3.5 PDA培養(yǎng)基（1 L）

馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖 15 g，瓊脂 15 g，自然pH.

上述培養(yǎng)基均在121℃滅菌20 min，備用.

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 嗜鐵素檢測

采用Schwyn等[9]的研究方法，并結(jié)合趙翔等[10]改進(jìn)的方法進(jìn)行嗜鐵素檢測.將熒光假單胞菌RB5接種在鉻天青（CAS）藍(lán)色平板上，28℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落周圍顏色變化.

1.4.2 RB5菌株的種子培養(yǎng)

將熒光假單胞菌RB5在Kings'B平板上28℃活化24 h.活化后，用接種環(huán)挑取單菌落，接入5mL液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h.再接種到固體種子培養(yǎng)基中，在28℃下培養(yǎng)24 h.將培養(yǎng)好的一級種子用接種環(huán)挑取一環(huán)，接入50mL（250 mL搖瓶）液體培養(yǎng)基中，28℃，150 r/min的搖床中培養(yǎng)24 h，獲得二級種子.

1.4.3 RB5產(chǎn)嗜鐵素的發(fā)酵條件優(yōu)化

發(fā)酵培養(yǎng)基先用1 g 8-羥基喹啉處理除去痕量鐵，參考王偉等[8]的方法，分別改變以下發(fā)酵影響條件.

1.4.3.1 起始pH

將除鐵后的發(fā)酵培養(yǎng)基的起始pH分別設(shè)6.0、6.5、7.0、8.0、9.0共 5個處理.按 2%的接種量將二級種子接于50 mL（250 mL搖瓶）發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于溫度為28℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中培養(yǎng).每個處理設(shè)3個重復(fù)，取平均值.

1.4.3.2 接種量

接種量設(shè) 0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%5個處理.其他培養(yǎng)條件和檢測方法同1.4.3.1.

1.4.3.3 裝瓶量

裝瓶量設(shè) 30 mL/250 mL、50 mL/250mL、70 mL/250mL、90mL/250mL、120mL/250mL 5個處理.培養(yǎng)條件和檢測方法同1.4.3.1.

1.4.3.4 發(fā)酵時間

發(fā)酵時間設(shè) 6 h、12 h、24 h、36 h、48 h、60 h共6個處理.其他培養(yǎng)條件和檢測方法同1.4.3.1.

1.4.3.5 Fe3+

在除鐵后的發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適量的FeCl3，使鐵離子質(zhì)量濃度分別為 0.0 mg/L、0.4 mg/L、0.8 mg/L、1.0mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L.其他培養(yǎng)條件和檢測方法同1.4.3.1.

1.4.4 嗜鐵素含量的測定

多項研究表明，400 nm處的光吸收值可以作為檢測熒光假單胞菌嗜鐵素產(chǎn)量的方法，并且嗜鐵素的量與吸光值大小成正比[11-12].因此，本試驗以O(shè)D400的大小來衡量嗜鐵素的產(chǎn)量.將發(fā)酵液于4 000 r/min離心15 min，取上清液，用紫外分光光度計法在400 nm處檢測嗜鐵素含量.吸光度越大，表明嗜鐵素含量越高.

1.4.5 發(fā)酵液對禾谷絲核菌的抑制試驗

將以上不同處理得出的最佳發(fā)酵影響因素綜合起來再進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液離心后取上清液，利用菌絲生長速率抑制法[12]測定發(fā)酵液對禾谷絲核菌的抑制能力.以不加發(fā)酵液的培養(yǎng)基為對照，25℃下培養(yǎng)5～7 d后，當(dāng)對照組培養(yǎng)基的菌落直徑為培養(yǎng)皿直徑的80%時，用十字交叉法測量菌餅直徑.菌餅擴展直徑（mm）為菌餅的平均直徑（mm）與接種菌餅直徑（6 mm）之差，用下述公式計算抑制率：

抑制率=（對照組菌餅擴展直徑-處理組菌餅擴展直徑）/對照組菌餅擴展直徑.

1.4.6 統(tǒng)計分析

運用DPS軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析，方差分析采用Duncan新復(fù)極差法檢測.

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜鐵素的檢測

CAS藍(lán)色平板含有鉻天青、鐵離子和溴化十六碳烷基三甲銨（HTDMA）組成的復(fù)合物而呈藍(lán)色，當(dāng)藍(lán)色檢測平板中的鐵離子被微生物分泌的鐵載體奪走時，即可在微生物生長的菌落周圍形成橘黃色暈圈[7].熒光假單胞菌RB5在鉻天青（CAS）藍(lán)色平板上培養(yǎng)48 h后，與對照大腸桿菌（E.coli）相比，菌落周圍形成橘黃色的暈圈.由此可以確定菌株RB5能夠產(chǎn)生與鐵離子有高親和力的物質(zhì)——嗜鐵素.

2.2 起始pH對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

起始pH直接影響熒光假單胞菌的菌體生長，進(jìn)而影響到嗜鐵素的分泌量.將發(fā)酵培養(yǎng)基分別調(diào)到不同的起始pH值進(jìn)行發(fā)酵，由圖1可以看出，隨著pH值增大，OD400先上升后下降，當(dāng)起始pH為7.0的時候，嗜鐵素的產(chǎn)量最高.表明過酸或過堿的pH環(huán)境均不利于嗜鐵素的分泌.用DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan極差法進(jìn)行檢測，pH為7.0時與其他pH條件下的嗜鐵素產(chǎn)量呈顯著差異（P<0.05）.

圖1 起始pH對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

2.3 接種量對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

接種量的大小影響發(fā)酵的產(chǎn)量和發(fā)酵周期.接種量小的時候，延遲期變長，發(fā)酵時間延長；接種量變大時，菌體迅速生長，通風(fēng)條件惡化，從而降低發(fā)酵單位.5個不同接種量處理對嗜鐵素產(chǎn)量的影響見圖2，可以看出以2%接種量為最佳.統(tǒng)計分析顯示，P=0.000 1<0.01，組間差異極顯著，說明接種量對嗜鐵素含量有極大的影響.

圖2 接種量對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

2.4 裝瓶量對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

裝瓶量的多少關(guān)系到發(fā)酵時的通氣量，通氣量是影響微生物菌體生長和代謝物生成的重要因素[13].在250mL的三角瓶中分別裝30mL、50mL、70 mL、90mL、120mL的發(fā)酵液進(jìn)行試驗，結(jié)果如圖3所示，在瓶裝量為90 mL時，嗜鐵素的產(chǎn)量最多，并且與其他瓶裝量處理后的嗜鐵素含量呈顯著性差異（P<0.05）.

圖3 裝液量對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

2.5 發(fā)酵時間對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

對發(fā)酵時間做不同的6個處理，由圖4可看出，隨著時間的延長，400 nm處的吸光值一直上升，在48 h達(dá)到最大值，之后慢慢下降，表明嗜鐵素的分泌在48 h最多，說明48 h即為最佳的發(fā)酵時間.統(tǒng)計分析顯示，發(fā)酵時間為48 h與發(fā)酵時間為36 h的嗜鐵素含量相比，差異不顯著（P>0.05）；同發(fā)酵時間為 6 h、12 h、24 h、60 h的嗜鐵素含量相比，差異顯著（P<0.05）.

圖 4 發(fā)酵時間對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

2.6 Fe3+對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

嗜鐵素的含量受Fe3+的影響，F(xiàn)e3+的含量越多，合成越少，反之則越多，但Fe3+過少時，細(xì)胞生長受抑制，嗜鐵素的合成反而減少.如圖5所示，當(dāng)Fe3+的質(zhì)量濃度為0.8 mg/L時，嗜鐵素的含量最高.統(tǒng)計分析顯示，在P=0.05的水平上，F(xiàn)e3+質(zhì)量濃度為0.8mg/L與Fe3+質(zhì)量濃度為1.2mg/L、1.6mg/L時的嗜鐵素含量差異不顯著，與Fe3+質(zhì)量濃度為0.0 mg/L、0.4 mg/L時的嗜鐵素含量相比，差異顯著（P<0.05）.

圖5 Fe3+質(zhì)量濃度對嗜鐵素產(chǎn)量的影響

2.7 RB5發(fā)酵液對禾谷絲核菌生長的影響

熒光假單胞菌RB5發(fā)酵液（OD400值2.35）對禾谷絲核菌的生長影響見圖6.與對照相比，禾谷絲核菌菌餅在含有發(fā)酵液的培養(yǎng)基中生長6 d后，受到了明顯抑制.發(fā)酵液對病原菌的抑菌活性高達(dá)65.28%，表明嗜鐵素產(chǎn)量的提高能夠有效抑制禾谷絲核菌的生長.

圖6 發(fā)酵液對禾谷絲核菌生長的影響

3 結(jié)論

通過CAS法定性檢測分析，發(fā)現(xiàn)熒光假單胞菌RB5在培養(yǎng)基中分泌爭奪鐵離子的代謝物，使菌落周圍藍(lán)色退去，形成橘黃色的暈圈.表明RB5確能產(chǎn)生嗜鐵素.菌體的良好生長需要培養(yǎng)基各組分濃度和比例合適，碳源和氮源對菌體的生長或蛋白的表達(dá)影響較大，濃度太低會造成營養(yǎng)缺乏，限制菌體正常生長，進(jìn)而影響代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[14].試驗中所采用的發(fā)酵培養(yǎng)基是實驗室經(jīng)過優(yōu)化培養(yǎng)條件后的培養(yǎng)基，菌體生長好、抑菌活性強，故本試驗中未安排培養(yǎng)基、碳源和氮源等因素的優(yōu)化.研究了起始pH、接種量、瓶裝量、發(fā)酵時間、Fe3+質(zhì)量濃度對嗜鐵素產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明：pH7.0最適合于RB5分泌嗜鐵素，處于熒光假單胞菌的最適生長pH值范圍；2%的接種量對嗜鐵素產(chǎn)生有利；最佳裝瓶量為90 mL/250 mL，與王偉等[8]的研究結(jié)果稍有差別，可能是因為所用發(fā)酵培養(yǎng)基不同而致.48 h為嗜鐵素產(chǎn)量最多的發(fā)酵時間，本實驗室前期研究結(jié)果顯示，熒光假單胞菌在這個時期的發(fā)酵液抗菌活性最強；0.8 mg/L的Fe3+能夠使RB5嗜鐵素產(chǎn)量最多，與王偉等[8]的研究結(jié)果相同.本研究得出的熒光假單胞菌RB5產(chǎn)嗜鐵素的最佳發(fā)酵條件可為嗜鐵素的分離純化及其工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)，使其能更廣泛地應(yīng)用于微生物生物防治、醫(yī)藥等領(lǐng)域.

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FERMENTATION CONDITIONSOF SIDEROPHORE PRODUCED BY PSEUDOMONAS FLUORESCENS RB5

YIYan-jie，ZHOU Guang-zhou，SHIYu，LIRui-fang，CHEN Xiao-di
（School of Bioengineering， Henan University of Technology， Zhengzhou 450001，China）

Pseudomonas fluorescens RB5 antagonistic to Rhizoctonia cerealis was isolated from the soil.Through CAS detection,we found that strain RB5 could secrete siderophores.In order to study the optimum fermentation conditions of siderophore produced by Pseudomonas fluorescens RB5,we studied the influence of different culture conditions on the yield of siderophore from strain RB5 by using shaking flask fermentation and 400-nm specific spectral absorption assay.The results showed that the optimum culture conditions of siderophore were as follows:initial pH 7.0,inoculation amount 2%,culture time 48 hours,medium bottling amount 90 m L/250 m L,Fe3+mass concentration 0.8 mg/L.The inhibition experiment indicated that strain RB5 fermentation broth (OD4002.35)had a strong inhibition effect on Rhizoctonia cerealis and the inhibition rate was up to 65.28%.

Pseudomonas fluorescens； siderophore； fermentation conditions； inhibition effect

TQ920.1

B

CNKI:41-1378/N.20111220.1501.007

1673-2383(2011)06-0032-04

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20111220.1501.007.html

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2011-12-20 03:01:44PM

2011-07-05

河南省教育廳自然科學(xué)基金（2010A210003）；河南工業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金（2010BS016）

伊艷杰（1978-），女，河南許昌人，副教授，博士，研究方向為微生物防治.