陳齊勇,張文兵,麥康森,馬洪明,劉付志國

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266003)

水生動(dòng)物由于生活環(huán)境較為復(fù)雜,體內(nèi)的活性氧(ROS)水平常因水中溶解氧、溫度以及毒素等環(huán)境因子的異常變化而升高,以至超過自身抗氧化系統(tǒng)的清除能力,這時(shí)過量的ROS由于其高度活躍的化學(xué)性質(zhì)往往引起蛋白、脂肪、核酸等生物大分子氧化進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞損傷[1-2]。大量研究表明,多種疾病的發(fā)生都與體內(nèi)的ROS水平有著直接的關(guān)系[3]。因此,關(guān)注水生動(dòng)物的健康應(yīng)該對其體內(nèi)氧化和抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡引起重視。

硫辛酸的抗氧化功能在眾多的“離體”和“在體”試驗(yàn)中都已得到證實(shí)[3-5]。它不僅能夠清除氧自由基、螯合重金屬離子,還具有修復(fù)氧化損傷的作用[3]。然而,硫辛酸同時(shí)具有促氧化效應(yīng)[3],這主要取決于氧化應(yīng)激的形式和機(jī)體的生理狀態(tài)[6]。目前為止,對硫辛酸的抗氧化作用的研究主要集中于陸生脊椎動(dòng)物[7-10],在水生動(dòng)物中發(fā)表的相關(guān)數(shù)據(jù)較少。

硒是動(dòng)物必需的微量元素,也是1種潛在的抗氧化劑,常作為谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心參與抗氧化作用[11]。Tirosh等[12]對H T4神經(jīng)細(xì)胞株的研究發(fā)現(xiàn),硒和硫辛酸的協(xié)同作用能更為有效地保護(hù)細(xì)胞免受谷氨酸鹽的氧化損傷。萬敏等[13]研究發(fā)現(xiàn)飼料中硒和維生素E的相互作用顯著影響皺紋盤鮑血清過氧化氫酶(CA T)、谷胱甘肽還原酶(GR)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)的活性。當(dāng)飼料中含有450 IU/kg的維生素E時(shí),添加0.6 mg/kg的硒能使皺紋盤鮑血清中的抗氧化物酶系統(tǒng)總體達(dá)到相對平衡,從而有效的抵抗氧化脅迫[13]。

在影響皺紋盤鮑抗氧化能力的營養(yǎng)因子方面,發(fā)表的數(shù)據(jù)主要集中在維生素上,如維生素D[14]、維生素A[15]、維生素E[16]、維生素E和硒的交互作用[13]。本研究的目的是探討飼料中硒和硫辛酸對皺紋盤鮑抗氧化反應(yīng)的影響,為從營養(yǎng)途徑提高皺紋盤鮑抗氧化脅迫的能力提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼料配制

基礎(chǔ)飼料參照Mai等[17]的配方,以酪蛋白和明膠為蛋白源,鯡魚油和大豆油(1∶1)為脂肪源,糊精為主要糖源,輔以纖維素、維生素、礦物質(zhì)等配制而成。利用2×3的雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì),分別添加硒(0,1 mg/kg)和硫辛酸(0,800,3 200 mg/kg)配制成6種半精制飼料。其中,硫辛酸(純度98%,DL-α-Lipoic acid)由Lancaster公司提供,硒源為Na2SO3·5H2O?；A(chǔ)飼料中常規(guī)指標(biāo)包括粗蛋白、粗脂肪和粗灰分的測定參照AOAC[18]。

飼料制作參照Zhang等[19],稍作修改,原料經(jīng)粉碎過100目篩后,用電子天平按配方比例準(zhǔn)確稱取,將其充分混勻,輔以其質(zhì)量的80%左右的蒸餾水揉勻,搟薄(厚度約0.5 mm)切割成約1 cm2的薄片。片狀飼料要在5%(g/L)的氯化鈣溶液中浸泡約1 min,使褐藻酸鈉轉(zhuǎn)變成為穩(wěn)定不溶于水的褐藻酸鈣凝膠,以減少營養(yǎng)物質(zhì)的溶失。飼料風(fēng)干后密封于樣品袋中并保存在-20℃冰柜中待用。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組和養(yǎng)殖管理

皺紋盤鮑稚鮑購自青島鰲山衛(wèi)育苗場,為當(dāng)年人工孵化的同一批鮑苗。經(jīng)暫養(yǎng)2周后挑選規(guī)格一致的健康個(gè)體(平均體質(zhì)量(0.43±0.00)g)隨機(jī)分成6組,每組3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)50只鮑魚。

表1 基礎(chǔ)飼料配方及其營養(yǎng)成分Table 1 Ingredient and proximate composition of the basal diet

生長試驗(yàn)在中國海洋大學(xué)鰲山衛(wèi)實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行,流水養(yǎng)殖16周。試驗(yàn)期間,每天17··00投喂,次日08··00清底,并密切觀察稚鮑采食及健康狀況。養(yǎng)殖過程中水溫15～25℃,鹽度22～28,p H=7.4～7.9,溶解氧不低于6 mg/L,水體中硒含量為1.54μg/L。

1.3 樣品的采集和處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí),停喂稚鮑3 d以排空其腸道內(nèi)容物。收集肝胰臟,將其剪成小塊混勻后分裝在小管中,所有樣品保存在-80℃冰箱中待測。肝胰臟樣品使用前解凍,加入預(yù)冷的勻漿介質(zhì)(0.86%生理鹽水,質(zhì)量濃度=1/9),冰上勻漿,然后4℃、4 000 r/min離心15 min,取上清測定抗氧化指標(biāo)。

參考B radfo rd[20]的考馬斯亮蘭法測定肝胰臟勻漿液中蛋白質(zhì)的含量,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。過氧化氫酶(CA T)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)活力的測定參照萬敏等[13]的方法;丙二醛(MDA)的測定參照Sahin等[21]的硫代巴比妥酸法;總抗氧化力(T-AOC)測定采用鐵離子還原/抗氧化力測定法(FRAP),參考Benzie和Strain[22];谷胱甘肽(GSH)用比色法測定,參照Anderson等[23]。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0軟件和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。用百分?jǐn)?shù)表示的數(shù)據(jù)先轉(zhuǎn)化成反正弦方根后再進(jìn)行方差分析。差異顯著時(shí)用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。顯著水平為0.05。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 超氧化物歧化酶(SOD)

從表2可以看出,硫辛酸顯著影響了肝胰臟中SOD活力(P<0.05),硒及硒與硫辛酸的交互作用對SOD都無顯著影響(P>0.05)。SOD活力在添加800 m g/kg硫辛酸的兩處理組顯著高于0 m g/kg添加組(P<0.05),3 200 mg/kg硫辛酸處理組與對照組無顯著差異(P>0.05)。

2.2 谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)

硫辛酸和硒對皺紋盤鮑肝胰臟中GPX活性均有顯著影響(P<0.05)(見表2),但無顯著交互作用(P>0.05)。當(dāng)飼料中不添加硫辛酸時(shí),硒顯著提高了GPX活性;在添加800和3 200 mg/kg硫辛酸后,硒添加組GPX活力比不添加組有所增加,但差異不顯著(P>0.05)。飼料中添加800 mg/kg硫辛酸顯著提高了GPX活性,3 200 m g/kg硫辛酸則降低了其活性(P<0.05)。

表2 飼料中添加α-硫辛酸(LA)和硒(Se)對皺紋盤鮑稚鮑肝胰臟中抗氧化指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=3)Table 2 Effects of diet supplementedα-lipoic acid(LA)and selenium(Se)on anti-oxidative parameters in hepatopancreas of juvenile abalone,Haliotis discus hannai Ino(mean±S.E.,n=3)

2.3 谷胱甘肽(GSH)

如表2所示,硫辛酸顯著影響肝胰臟中GSH含量,硒對GSH影響不顯著且和硫辛酸無顯著交互作用。但在添加硫辛酸后,1 mg/kg硒添加組的GSH水平相比缺乏組表現(xiàn)出增加的趨勢。在添加和不添加硒的情況下,GSH水平都隨硫辛酸添加量的增加而增加,其中在同時(shí)添加1 mg/kg硒和3 200 mg/kg硫辛酸的處理組GSH最高,并顯著高于對照組(P<0.05)。

2.4 過氧化氫酶(CA T)

不同處理的稚鮑的CA T在1.29～1.78之間(見表2),硒和硫辛酸對CA T都無顯著影響,亦無顯著交互作用(P>0.05)。

2.5 丙二醛含量(MDA)

皺紋盤鮑稚鮑的MDA值在3.59～4.18之間變化(見表2),各處理組間無顯著差異(P>0.05)。但添加硒和800 m g/kg硫辛酸時(shí)MDA值低于對照組,而添加3 200 mg/kg硫辛酸表現(xiàn)出升高的趨勢。

2.6 總抗氧化力(T-AOC)

T-AOC值的變化如表2所示,硒和硫辛酸分別顯著影響了稚鮑肝胰臟T-AOC值(P<0.05),但兩者無交互作用(P>0.05)。在飼料中添加0和3 200 mg·kg-1的硫辛酸時(shí),1 mg/kg的硒顯著增加了T-AOC值(P<0.05),而添加800 m g/kg硫辛酸時(shí),硒對T-AOC值影響不顯著(P>0.05)。無論添加或不添加硒,在800 mg/kg處理組T-AOC升高,在3 200 mg/kg組降低,最低值出現(xiàn)在不添加硒同時(shí)添加3 200 mg/kg硫辛酸的處理組,顯著低于對照組(P<0.05)。

3 討論

SOD、GPX和CA T都是抗氧化系統(tǒng)中主要的抗氧化酶,SOD催化超氧自由基的歧化反應(yīng),在維持生物體內(nèi)活性氧的動(dòng)態(tài)平衡、增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和整個(gè)機(jī)體的免疫功能中起著重要作用;GPX幫助阻止氫過氧化物和有機(jī)過氧化物的形成,該酶活性降低,則引起自由基和過氧化物積累,進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)和細(xì)胞膜氧化損傷[24];CA T是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的抗氧化酶,催化過氧化氫降解。這幾種抗氧化酶常被用于衡量機(jī)體的抗氧化狀態(tài)。T-AOC是用于評價(jià)機(jī)體抗氧化系統(tǒng)性能的綜合性指標(biāo)[25]。

在本研究中,飼料中添加800 mg/kg硫辛酸時(shí),皺紋盤鮑稚鮑肝胰臟中SOD和GPX活力顯著提高,硫辛酸表現(xiàn)出抗氧化作用,與Kow luru和Odenbach[26]在小鼠上的研究結(jié)果一致;而添加3 200 mg/kg硫辛酸時(shí)SOD和GPX活力下降,與不添加硫辛酸的對照組的值之間沒有顯著差異。皺紋盤鮑肝胰臟中TAOC的變化趨勢也與SOD和GPX這2種酶相似,并且在硫辛酸添加量為3 200 mg/kg時(shí)T-AOC的值顯著低于對照組和800 mg/kg添加組。另外,盡管肝胰臟中MDA的含量沒有受到飼料中硫辛酸添加量的顯著影響,但是存在飼料中添加3 200 mg/kg硫辛酸有提高M(jìn)DA含量的趨勢。因此,從SOD、GPX、T-AOC和MDA隨飼料中硫辛酸不同添加量的變化情況來看,800 mg/kg是飼料中硫辛酸的適宜添加量,當(dāng)添加量達(dá)到3 200 mg/kg時(shí),有降低體內(nèi)抗氧化能力而提高氧化脅迫的趨勢。在其它的一些研究中也發(fā)現(xiàn)硫辛酸具有促氧化作用[3],這主要取決于氧化應(yīng)激的形式和機(jī)體的生理狀態(tài)。飼料中過量添加硫辛酸對皺紋盤鮑機(jī)體造成潛在的氧化脅迫的機(jī)理值得開展進(jìn)一步的研究。

GSH是體內(nèi)GPX分解過氧化物必需的底物,被認(rèn)為是衡量機(jī)體抗氧化能力的重要指標(biāo)[27]。在本研究中,GSH隨著硫辛酸添加量的增加而升高,這與GPX、SOD和T-AOC的變化趨勢不同。GSH的持續(xù)升高可能與硫辛酸促進(jìn)了用于合成GSH的半胱氨酸的運(yùn)輸有關(guān)[28],或是因?yàn)榱蛐了嵩黾恿薌SH合成酶的活性[10]。由此可見,如何正確使用體內(nèi)GSH的變化情況來評價(jià)硫辛酸影響下機(jī)體的抗氧化能力,需要進(jìn)一步的商榷。

硒作為GPX的活性中心,是GPX發(fā)揮抗氧化作用的重要部分。值得一提的是本研究結(jié)果顯示在飼料中不添加硫辛酸時(shí),硒顯著提高了肝胰臟中GPX活性,這與萬敏等[13]對皺紋盤鮑的研究結(jié)果一致。但當(dāng)飼料中添加800和3 200 mg/kg硫辛酸時(shí),硒對GPX沒有顯著影響,說明硒對皺紋盤鮑GPX的作用是有條件的,本試驗(yàn)中受到硫辛酸的影響。另外,本研究中當(dāng)飼料中不添加硫辛酸或硫辛酸添加過量(3 200 mg/kg)時(shí),硒顯著提高肝胰臟中T-AOC的值。而在添加適量硫辛酸(800 mg/kg)時(shí),硒對T-AOC的影響不顯著,說明硫辛酸也影響了硒對T-AOC的作用。反之,硒也影響了硫辛酸對T-AOC的作用,當(dāng)飼料中沒有添加硒時(shí),硫辛酸(800 mg/kg)顯著提高了肝胰臟中TAOC水平,但當(dāng)飼料中添加硒后,硫辛酸(800 mg/kg)對肝胰臟中T-AOC水平影響不顯著。由此可見,盡管沒有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性,飼料中硫辛酸和硒之間對皺紋盤鮑機(jī)體抗氧化狀態(tài)的影響有潛在的交互作用。為了更好的揭示這種交互作用,在今后的研究中應(yīng)該增加飼料中硒和硫辛酸的添加梯度。

[1] Freidovich I.Fundamental aspects of reactive oxygen species,or w hat’s the matter with oxygen?[J].New Yo rk:Academy of Sciences,1999,893:13-18.

[2] M cCo rd J M.The evolution of free radicals and oxidative stress[J].The American Journal of Medicine,2000,108(8):108-652.

[3] Packer L,Witt E H,Tritschler J.A lpha-lipoic acid as a biological antioxidant[J].Free radical biology medicine,1995,19:227-250.

[4] Biewenga G P,Haenen G R,Bast A.The pharmacology of the antioxidant lipoic acid[J].General Pharmacology,1997,29:315-331.

[5] Bast A,Haenen G.Lipoic acid:amultifunctional antioxidant(reprinted from Thio Metabolism and Redox Regulation of Cellular Functions)[J].Bio Factors,2003,17:207-213.

[6] Cakatay U.Pro-oxidant actions of alpha-lipoic acid and dihydrolipoic acid.[J].Medical Hypotheses,2006,66:110-117.

[7] A rivazhagan P,Shila S,Kumaran S,et al.Effect of DL-α-lipoic acid on the status of lipid peroxidation and antioxidant enzymes in various brain regions of aged rats[J].Exerimental Gerontology,2002a,37:803-811.

[8] A rivazhagan P,Shila S,Narchonai E,et al.α-Lipoic acid enhances reduced glutathione,ascorbic acid,and alpha-tocopherol in aged rats[J].Anti-aging Medicine,2002b,5:265-269.

[9] Chae C H,Shin C H,Kim H T.The combination ofα-lipoic acid supplementation and aerobic exercise inhibits lipid peroxidation in rat skeletal muscles[J].Nutrition Research,2008,28:399-405.

[10] Fujita H,Shiosaka M,Ogino T,et al.α-Lipoic acid suppresses 6-hydroxydopa mine-induced ROS generation and apoptosis through the stimulation of glutathione synthesis but not by the exp ression of heme oxygenase-1[J].Brain Research,2008,1206:1-12.

[11] Wang Y B,Han J Z,Li W F,et al.Effect of different selenium source on grow th performances,glutathione peroxidase activities,muscle composition and selenium concentration of allogynogenetic crucian carp(Carassius auratus gibelio)[J].Animal Feed Science and Technology,2007,134:243-251.

[12] Tirosh O,Sen C K,Roy S,et al.Neurop rotective effectsofα-lipoic acid and itspositively charged am ide analogue[J].Free Radical Biology&Medicine,1999,26:1418-1426.

[13] 萬敏,麥康森,馬洪明,等.硒和維生素E對皺紋盤鮑血清抗氧化酶活力的影響[J].水生生物學(xué)報(bào),2004,28(5):496-503.

[14] 付京花,張文兵,麥康森,等.維生素D對皺紋盤鮑生長和體組織抗氧化反應(yīng)的影響[J].高技術(shù)通訊,2006,16(12):1306-1311.

[15] Fu J H,Zhang W B,Mai K S,et al.Effectsof dietary vitamin A on antioxidant responses of abalone Haliotis discus hannai Ino[J].Acta Oceanologica Sinica,2006,25(5):141-150.

[16] Fu J H,Zhang W B,Mai K S,et al.Effectsof vitamin Eon antioxidant enzyme activities and fatty accompositions in juvenile abalone Haliotis discus hannai Ino[J].Journal of Shellfish Research.2007,26(3):809-814.

[17] Mai K S,Zhang W B,Tan B P,et al.Effectsof dietary zinc on the shell biomineralization in abalone Haliotis discus hannai Ino[J].Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2003,283:51-62.

[18] Association of Official Analytical Chemists(AOAC).Official methods of analysis of official analytical chemists international[M].Arlington,VA,USA:Association of Official Analytical Chemists,1995.

[19] Zhang W,Mai K,Xu W,et al.Interaction between vitamins A and D on grow th and metabolic responses of abalone Haliotis discus hannai,Ino[J].Journal of Shellfish Research,2007,26:51-58.

[20] Bradford M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Analytical Biochemistry,1976,72:248-254.

[21] Sahin M,SagdIc G,Elmas O,et al.Effect of chronic restraint stress and alpha-lipoic acid on lipid peroxidation and antioxidant enzyme activities in rat peripheral organs[J].Pharmacol Research,2007,54:247-252.

[22] Benzie I F,Strain J J.The ferric reducing ability of plasma(FRAP)as ameasure of“Antioxidant Power”:the FRAP assay[J].Analytical Chemistry,1996,239:70-76.

[23] Anderson M E.Determination of glutathione and glutathione disulfide in biological samples[J].Methods in Enzymology,1985,113:548-55.

[24] Oliveros L,Vega V,Anzulovich A C,et al.Vitamin A deficiency modifies antioxidant defense and essential element contents in rat heart[J].Nutrition Research,2000,8:1139-1150.

[25] 方展強(qiáng),王春鳳.硒對汞致劍尾魚鰓和肝組織總抗氧化[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和比較醫(yī)學(xué),2005,25(3):136-139.

[26] Kowluru R A,Odenbach S.Effect of long-term administration of α-Lipoic acid on retinal capillary cell death and the development of retinopathy in diabetic rats[J].Diabetes,2004,53:3233-3238.

[27] 朱選,曹俊明,趙紅霞,等.飼料中添加谷胱甘肽對草魚組織中谷胱甘肽沉積和抗氧化能力的影響[J].水產(chǎn)科學(xué),2008,15(1):160-166.

[28] Han D,Handelman G,Marcocci L,et al.Lipoic acid increases denovo synthesis of cellular glutathione by improving cystine utilization[J].Bio Factors,1997,6:321-338.