雙殼類(lèi)分子生物標(biāo)志物對(duì)海水重金屬的響應(yīng)評(píng)述*

孟范平,高 鷹,趙順順,付海防,肖 靜

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島266100)

海洋雙殼類(lèi)動(dòng)物是一類(lèi)分布廣泛、主要營(yíng)固著、附著、埋棲和匍匐生活的濾食性生物,對(duì)重金屬有很強(qiáng)的富集作用,自1980年代以來(lái),在全球貽貝監(jiān)測(cè)計(jì)劃[1]、美國(guó)貽貝監(jiān)測(cè)計(jì)劃[2]、中國(guó)貽貝監(jiān)測(cè)計(jì)劃中均被作為指示生物應(yīng)用于海水重金屬污染監(jiān)測(cè)。由于重金屬在微量或痕量水平上即能產(chǎn)生毒性作用,而現(xiàn)有的化學(xué)分析技術(shù)靈敏度尚不足以檢出其存在,因此單獨(dú)測(cè)定雙殼類(lèi)體內(nèi)重金屬的蓄積量并不能客觀指示重金屬的生物效應(yīng);相反,環(huán)境中微量或痕量水平的污染物卻能引起生物細(xì)胞出現(xiàn)可被檢測(cè)的生理性改變,這些細(xì)胞被稱(chēng)為細(xì)胞生物標(biāo)志物(cell biomarkers),而介入該生理性變化的分子則被稱(chēng)為分子生物標(biāo)志物(molecular biomarkers,MBM s)[3]。MBM s可以通過(guò)分子水平上的變化,直接反映外來(lái)污染物與細(xì)胞靶分子的相互作用及其后果,具有較高的靈敏性和特異性,因而適于環(huán)境污染的早期預(yù)警[4]。

近20年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者在海水重金屬對(duì)雙殼類(lèi)動(dòng)物MBM s的影響方面進(jìn)行了大量研究,目的是篩選敏感、特異、容易測(cè)定的MBM s以滿足海水重金屬靈敏監(jiān)測(cè)的需要。鰓、消化腺(或內(nèi)臟)是雙殼類(lèi)動(dòng)物積累重金屬的重要器官,因此常被選為研究MBM s對(duì)重金屬響應(yīng)特征的組織材料。室內(nèi)暴露培養(yǎng)期間,為保證雙殼類(lèi)動(dòng)物生長(zhǎng)所需的適宜環(huán)境條件,供試海水溫度一般在17～25℃之間;p H值一般在7.8～8.6;鹽度多在30～35。根據(jù)國(guó)內(nèi)外在室內(nèi)受控條件以及現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查分析的研究結(jié)果,本文對(duì)雙殼類(lèi)中金屬硫蛋白(MTs)、熱激蛋白(HSP70)、抗氧化防御系統(tǒng)等MBM s對(duì)海水重金屬的響應(yīng)特征進(jìn)行了綜述,并結(jié)合我國(guó)在該領(lǐng)域研究中存在的問(wèn)題提出了今后應(yīng)重點(diǎn)研究的方向。

1 金屬硫蛋白(metallothioneins,MTs)

1.1 雙殼類(lèi)MTs的結(jié)構(gòu)與功能

MTs是生物體內(nèi)普遍存在的一類(lèi)低分子量(6000～7000D)、富含半胱氨酸(Cys),約占MTs總氨基酸數(shù)量的30%)、熱穩(wěn)定性高、可被金屬誘導(dǎo)的非酶蛋白。MTs通過(guò)Cys上的巰基(-SH)與金屬離子結(jié)合,使其具有雙重功能[5]:①與必需的金屬(Cu2+、Zn2+等)結(jié)合,在生物體內(nèi)合成金屬酶,可以調(diào)節(jié)這些金屬離子在細(xì)胞內(nèi)濃度,維持生物細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)進(jìn)程的動(dòng)態(tài)平衡;②與非必需的有毒重金屬(Pb2+、Cd2+等)結(jié)合,減少細(xì)胞與這些重金屬離子的非特異性結(jié)合,從而避免有害重金屬對(duì)生物體的毒害。雙殼類(lèi)動(dòng)物體內(nèi)通常含有多種類(lèi)型的MTs異構(gòu)體,包括MT-10、MT-20等,其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生理功能有所不同。有學(xué)者提出[6-7],MT-20是1種誘導(dǎo)蛋白,主要由Cd2+誘導(dǎo)表達(dá),對(duì)非必需金屬元素具有解毒功能;而MT-10則是生物體內(nèi)普遍存在的1種基礎(chǔ)蛋白,包括Cd2+在內(nèi)的多種金屬離子均可誘導(dǎo)其產(chǎn)生,主要參與生物體內(nèi)必需金屬元素的調(diào)節(jié)。

1.2 雙殼類(lèi)MTs對(duì)海水重金屬的響應(yīng)特征

1970年代末,就有學(xué)者提出水生生物MTs可作為重金屬暴露和毒性效應(yīng)早期預(yù)警的生物標(biāo)志物[8]。目前較為認(rèn)可的金屬離子誘導(dǎo)MTs的機(jī)理是金屬效應(yīng)因子(metal responsive element-binding transcription factors,MRTFs)機(jī)制,即:生物體內(nèi)的金屬響應(yīng)單元——金屬轉(zhuǎn)錄因子(MTF-1)受到金屬離子激活,發(fā)生變構(gòu),進(jìn)入細(xì)胞核,可對(duì)效應(yīng)基因進(jìn)行調(diào)控,促發(fā)MT基因表達(dá)[9]。

有關(guān)重金屬誘導(dǎo)雙殼類(lèi)MTs的大量研究結(jié)果(見(jiàn)表1)顯示:雙殼類(lèi)MTs誘導(dǎo)水平與重金屬濃度之間存在相關(guān)性,可以反映海水重金屬污染水平;當(dāng)重金屬濃度較低時(shí),雙殼類(lèi)MTs含量隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)而增加;重金屬濃度較高時(shí),MTs含量?jī)H在較短時(shí)間內(nèi)上升,而后呈下降趨勢(shì)[10]。Yong等[11]將太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)在含Cd2+(0.01～0.1 m g/L)海水中暴露11d后發(fā)現(xiàn),消化腺、鰓的MT m RNA表達(dá)量隨劑量增加而上升,高濃度Cd2+暴露后,消化腺和鰓MT m RNA表達(dá)量分別比對(duì)照組增加128倍和139倍。此外,Amiard[12]等研究發(fā)現(xiàn),重金屬V能誘導(dǎo)貽貝(My tilus sp.)MTs產(chǎn)生,且MTs的合成水平與總V、可溶態(tài)V含量之間均存在顯著正相關(guān)關(guān)系,可作為海洋V污染的有效生物標(biāo)志物。

重金屬對(duì)雙殼類(lèi)MTs的誘導(dǎo)程度因器官或組織而異(見(jiàn)表1)。同鰓、外套膜等組織相比,消化腺M(fèi)Ts更容易被誘導(dǎo),其含量隨著重金屬濃度升高而顯著增加,而鰓和外套膜的MTs含量變化不顯著甚至出現(xiàn)降低趨勢(shì)。這可能與組織結(jié)構(gòu)、功能不同有關(guān):鰓和外套膜是生物體接觸和吸收毒物的器官,但不是主要的累積部位;消化腺是機(jī)體的解毒器官,容易蓄積重金屬而誘導(dǎo)更多的MTs合成[13]。因此,通常認(rèn)為消化腺較適于作為監(jiān)測(cè)重金屬的MTs來(lái)源。然而,有些學(xué)者對(duì)太平洋牡蠣[17-18]、文蛤(Ruditapes decussates)[19]等研究發(fā)現(xiàn),消化腺M(fèi)Ts含量大于鰓,但消化腺M(fèi)Ts本底值較高,其相對(duì)增量小于鰓,因而認(rèn)為鰓更適于作為MTs監(jiān)測(cè)重金屬的組織材料。

表1 暴露于重金屬的海洋雙殼類(lèi)MTs響應(yīng)特征Table 1 Response of MTs in several bivalves exposed to heavy metals in seawater

污染海域現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定的重金屬對(duì)雙殼類(lèi)MTs的誘導(dǎo)水平與室內(nèi)急性暴露實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有顯著差異。室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)中,雖然生物體內(nèi)重金屬蓄積量有顯著增加,但對(duì)MTs的誘導(dǎo)量卻不及污染海域[21-22]。法國(guó)生態(tài)毒理研究中心的Geffard[20]等比較了這兩種暴露方式下金屬離子(Cd2+、Cu2+、Zn2+)對(duì)貽貝(M.edulis)MTs的誘導(dǎo)量:在室內(nèi)急性暴露實(shí)驗(yàn)條件下,以鰓為例,Cd2+含量比對(duì)照組增加242倍,而MTs的誘導(dǎo)量?jī)H增加3倍;相反,在重金屬污染海域,貽貝對(duì)3種金屬離子的蓄積量均較低,卻能顯著誘導(dǎo)MTs的合成,例如,消化腺Cd2+累積量?jī)H增加1倍,而MTs的誘導(dǎo)量卻增加0.4倍。Geffard等[17-18,20-23]進(jìn)一步研究提出,室內(nèi)重金屬暴露對(duì)紫貽貝(M.galloprovincialis)鰓MTs的誘導(dǎo)最強(qiáng),而污染海域則以消化腺M(fèi)Ts的誘導(dǎo)量最高;太平洋牡蠣MTs誘導(dǎo)的組織差異性與紫貽貝正好相反。Fernandez等[23]對(duì)西班牙地中海沿岸16個(gè)站位的紫貽貝測(cè)定結(jié)果表明,鰓中的MTs含量與任何重金屬不相關(guān),可能是因?yàn)轹w對(duì)重金屬的積累能力遠(yuǎn)小于消化腺,不足以誘導(dǎo)和積累明顯的MTs。因此,以MTs作為海水重金屬的生物標(biāo)志物時(shí),不僅要選用適宜的雙殼類(lèi)種類(lèi)和組織部位,還應(yīng)充分考慮現(xiàn)場(chǎng)暴露與室內(nèi)暴露對(duì)MTs誘導(dǎo)的差異性。

2 熱激蛋白70(HSP70)

2.1 HSP70的結(jié)構(gòu)與功能

熱激蛋白(HSPs)是生物體內(nèi)一組由熱逆境激活HSPs基因而高效表達(dá)的常見(jiàn)蛋白質(zhì)[24]。這些蛋白質(zhì)在進(jìn)化上高度保守,按其分子量可分為HSP27、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100等種類(lèi)。HSP70是熱激蛋白家族中最保守的一員,分子量約70kD,分子結(jié)構(gòu)主要由1個(gè)N端高度保守的44kD A TP酶功能域(A TP binding domain)和1個(gè)28kD的C端區(qū)域組成[25],其中,N-末端的A TP酶功能域可用于結(jié)合A TP。在正常細(xì)胞內(nèi)HSP70的水平較低,而在應(yīng)激狀態(tài)下升高較為明顯。高溫處理可以在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)HSP70合成,有利于修復(fù)、阻止細(xì)胞蛋白的逆境傷害和減少蛋白凝結(jié)。例如,在A TP存在條件下,HSP70可以使變性的RNA聚合酶重新獲得活性,使熱失活的熒光素酶活性恢復(fù)80%。

2.2 雙殼類(lèi)HSP70對(duì)海水重金屬的響應(yīng)特征

與MTs相似,生物體中的HSP70合成也會(huì)受到重金屬誘導(dǎo),誘導(dǎo)機(jī)制也非常相近[26]:進(jìn)入生物體的重金屬離子激活熱激轉(zhuǎn)錄因子(HSF),HSF釋放到細(xì)胞質(zhì)中,形成三聚體,遷移到細(xì)胞核內(nèi),與位于HSP70基因啟動(dòng)子區(qū)域的熱激單元(HSE)結(jié)合,激活HSP70基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄過(guò)程。這種誘導(dǎo)效應(yīng)在重金屬的濃度接近于環(huán)境背景值甚至更低水平時(shí)即能發(fā)生,使HSP70具備了作為環(huán)境重金屬污染預(yù)警指標(biāo)的潛力[27-29]。研究表明,海水中的重金屬在較短時(shí)間內(nèi)即能誘導(dǎo)雙殼類(lèi)動(dòng)物HSP70大量表達(dá),但暴露時(shí)間過(guò)長(zhǎng),生物體HSP70含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。克羅地亞里耶卡大學(xué)的Micovic等[30]研究發(fā)現(xiàn),將紫貽貝在Cd2+濃度為100～500μg/L的18℃海水中暴露24 h,消化腺中HSP70含量顯著增加,且與Cd2+濃度成線性關(guān)系(r=0.987 5)。意大利博洛尼亞大學(xué)Franzellitti等[31]的研究中,在溫度16℃、鹽度34的海水中,紫貽貝暴露于150μg/L(0.75μmol/L)的Hg2+,初期消化腺中HSP70的合成受到顯著誘導(dǎo),并在暴露24 h時(shí)達(dá)到最大值,而后HSP70含量逐漸下降。

重金屬的種類(lèi)及其化學(xué)形態(tài)可能影響其對(duì)海洋雙殼類(lèi)動(dòng)物HSP70的誘導(dǎo)。例如,Franzellitti等[32]發(fā)現(xiàn),紫貽貝在Cr6+濃度為1、10 ng/L的海水(溫度16℃、鹽度34)中暴露培養(yǎng)1周,消化腺中HSP70含量顯著低于對(duì)照組。在同樣溫度和鹽度的海水中[31],0.75μM的CH3Hg+并未像Hg2+那樣誘導(dǎo)HSP70合成,而是明顯抑制了紫貽貝消化腺中HSP70的表達(dá)。由此認(rèn)為,雙殼類(lèi)動(dòng)物對(duì)于不同種類(lèi)和形態(tài)的污染物可產(chǎn)生不同的細(xì)胞保護(hù)性響應(yīng)。

雖然室內(nèi)受控條件下的研究大多認(rèn)為雙殼類(lèi)動(dòng)物的HSP70對(duì)海水中微量重金屬能夠迅速響應(yīng)(誘導(dǎo)或抑制),但是,現(xiàn)場(chǎng)條件下將其作為生物標(biāo)志物的研究卻少得多。由于生物細(xì)胞內(nèi)的HSP70對(duì)于低溫、高溫以及p H、鹽度、溶解氧的變化也會(huì)產(chǎn)生響應(yīng),使得HSP70對(duì)海水重金屬的指示效果受到較多干擾。其中,溫度變化對(duì)暴露于重金屬的雙殼類(lèi)HSP70響應(yīng)的影響受到較多關(guān)注。適宜溫度(紫貽貝18℃[32]、美洲牡蠣(Crassostrea virginica)12℃[33])的海水不會(huì)影響到重金屬對(duì)雙殼類(lèi)HSP70的誘導(dǎo)效果。當(dāng)環(huán)境溫度比生物適宜生長(zhǎng)溫度提高或降低5～10℃以上時(shí),則可明顯誘導(dǎo)雙殼類(lèi)HSP70的合成[34-35]。相對(duì)而言,低溫下HSP70的誘導(dǎo)更適于作為重金屬暴露的生物標(biāo)志物。因此,利用雙殼類(lèi)HSP70作為海水重金屬的生物標(biāo)志物時(shí),應(yīng)盡可能保持各監(jiān)測(cè)站位的溫度一致。

3 抗氧化防御系統(tǒng)(Antioxidant defense system)

抗氧化防御系統(tǒng)是生物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)。當(dāng)暴露于可產(chǎn)生氧化還原循環(huán)的污染物(重金屬等)時(shí),機(jī)體內(nèi)將產(chǎn)生超氧陰離子(O-2·)、羥基(·OH)、單線態(tài)氧(1O2)和過(guò)氧化氫(H2O2)等活性氧。在重金屬暴露初期或濃度較低時(shí),生物體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)受到激活,能有效清除活性氧,防止其造成的氧化損傷,但是,當(dāng)體內(nèi)污染物含量隨暴露時(shí)間延長(zhǎng)而積累到一定程度時(shí),活性氧產(chǎn)生速度超出抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力,就會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化脅迫,引起脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA鏈斷裂、堿基核糖基氧化、酶蛋白膠聯(lián)以至細(xì)胞死亡或癌變[36]。在有關(guān)海水重金屬對(duì)雙殼類(lèi)動(dòng)物抗氧化防御系統(tǒng)影響的研究中,涉及較多的抗氧化劑包括:超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CA T)、谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GPx)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(GST)、谷胱甘肽還原酶(GR)等。

3.1 SOD和CA T對(duì)海水重金屬的響應(yīng)特征

SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以及線粒體內(nèi)外膜之間,是機(jī)體內(nèi)O-2·的天然消除劑,能催化O-2·發(fā)生歧化反應(yīng)生成H2O2和O2[37]。大多數(shù)有關(guān)海水重金屬對(duì)雙殼類(lèi)SOD活性影響的研究(見(jiàn)表2)發(fā)現(xiàn),低濃度或短時(shí)間的重金屬暴露均能誘導(dǎo)雙殼類(lèi)SOD的活性,但是隨著暴露時(shí)間延長(zhǎng)或者濃度增加,這種誘導(dǎo)幅度逐漸變小,甚至出現(xiàn)抑制[38-44,48],呈現(xiàn)“拋物線型”的劑量-效應(yīng)關(guān)系[38]。例如,近江牡蠣(Crassostrea ribularis)分別在含高、中、低濃度的Cd2+(0.1、0.5、1.5 m g/L)、Cu2+(0.1、0.5、1.5 mg/L)、Pb2+(0.2、1.0、3.0 mg/L)、Zn2+(0.2、1.0、3.0 mg/L)的海水中暴露6 d,無(wú)論是消化腺還是鰓,SOD活性均表現(xiàn)為“低揚(yáng)高抑”變化趨勢(shì)[39,41]。有學(xué)者認(rèn)為[38-39],低濃度污染物對(duì)SOD活性的誘導(dǎo)作用可認(rèn)為是生物體對(duì)污染的應(yīng)激反應(yīng),以增強(qiáng)機(jī)體消除活性氧自由基的能力;高濃度污染物對(duì)SOD活性的抑制作用則意味著污染逆境對(duì)生物體的作用已超過(guò)機(jī)體的適應(yīng)能力,其所導(dǎo)致的酶活性降低是中毒反應(yīng)的前兆。個(gè)別研究則發(fā)現(xiàn),重金屬暴露后期,經(jīng)歷“低揚(yáng)高抑”的SOD會(huì)再被激活[45]。過(guò)低濃度的重金屬時(shí)一般不會(huì)引起SOD活性明顯變化。例如,將櫛孔扇貝(Ch lam ys farreri)分別在Hg2+、Cu2+濃度為0.05μg/L和3μg/L的海水中培養(yǎng)96 h,消化腺的SOD活性與對(duì)照組無(wú)顯著差異[49]。利用0.2 mg/L的Zn2+培養(yǎng)近江牡蠣6 d,未觀察到消化腺SOD活性的明顯變化。

表2 暴露于海水重金屬后雙殼類(lèi)SOD和CA T的響應(yīng)Table 2 Responses of SOD and CA T in several bivalves exposed to heavy metals in seawater

CA T是一類(lèi)末端氧化酶,主要功能是將體內(nèi)的H2O2分解成O2和H2O,減輕H2O2對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。與SOD不同,較低濃度的重金屬誘導(dǎo)雙殼類(lèi)CA T活性的情況十分少見(jiàn),只有趙元鳳等報(bào)道0.01 mg/L的Cd2+培養(yǎng)毛蚶(Scapharca ubcrenata)6 d后,肌肉中CA T活性比對(duì)照增加49%[39]。部分研究發(fā)現(xiàn),隨著海水重金屬濃度的增加或暴露時(shí)間延長(zhǎng),雙殼類(lèi)CA T活性受到較大抑制[39,42-44,46,49]。例如,將毛蚶在含Cd2+海水中培養(yǎng)6 d,當(dāng)Cd2+濃度依次為0.1、0.5、1.0 m g/L時(shí),肌肉CA T活性受到明顯抑制[37]。也有部分學(xué)者的研究表明,重金屬不能引起CA T活性的明顯變化:櫛孔扇貝分別在Hg2+、Cu2+濃度為0.05和3μg/L的海水中培養(yǎng)96 h,消化腺CA T活性基本沒(méi)有變化[49];翡翠貽貝(P.viridis)在含Hg2+0.045 mg/L的海水中暴露10 d,消化腺CA T活性與對(duì)照無(wú)差異,直至15 d才觀察到活性顯著升高[16]。這可能是因?yàn)橹亟饘贊舛冗^(guò)低或者受試動(dòng)物CAT的敏感性不高。雖然許多學(xué)者認(rèn)為CAT是1種對(duì)氧化逆境敏感性?xún)?yōu)于SOD的生物標(biāo)志物[50],但是綜合表2的文獻(xiàn)結(jié)論,雙殼類(lèi)動(dòng)物CAT對(duì)重金屬的敏感性不及SOD。

2種抗氧化酶對(duì)重金屬的響應(yīng)程度因重金屬的種類(lèi)、雙殼類(lèi)動(dòng)物組織器官的不同而存在明顯差異。江天久等[40-41]將近江牡蠣分別在含有低濃度重金屬的海水中暴露6 d,以鰓SOD、消化腺SOD的誘導(dǎo)倍數(shù)作為敏感性評(píng)價(jià)指標(biāo),4種重金屬對(duì)2種組織中SOD的誘導(dǎo)能力由大到小的順序?yàn)?Cd2+>Cu2+>Pb2+>Zn2+,表明近江牡蠣SOD對(duì)Cd2+最為敏感。

3.2 GSH及其相關(guān)酶類(lèi)對(duì)海水重金屬的響應(yīng)特征

谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸構(gòu)成的三肽,分為氧化型(GSSG)和還原型(GSH)2種。GSH是通過(guò)捕獲氧自由基防止細(xì)胞膜發(fā)生類(lèi)脂過(guò)氧化的最重要抗氧化劑之一[46]。其功能是作為GPx和GST的底物,以清除機(jī)體內(nèi)的活性氧自由基(·OH、H2O2和1O2等)和脂質(zhì)過(guò)氧化物。其中,GPx通過(guò)催化GSH與H2O2或有機(jī)過(guò)氧化物(ROOH+2GSH→ROH+H2O+GSSG)反應(yīng),有效阻止自由基引起的氧化損傷;GST是位于細(xì)胞漿中防御外源性化合物的解毒酶,能催化GSH分子通過(guò)-SH、-N H2、-COOH以及肽鍵與重金屬離子結(jié)合,自身被氧化為GSSG[46],表現(xiàn)為生物體內(nèi)GSH含量以及GSH/GSSG比值降低。為了維持細(xì)胞正常代謝功能所需的適宜GSH/GSSG比例,細(xì)胞中的GR利用NADPH作為電子供體,催化GSSG的二硫鍵還原,重新生成GSH,以保持細(xì)胞的氧化還原特征。

雙殼類(lèi)動(dòng)物的GSH及其相關(guān)酶類(lèi)能夠?qū)Ｋ亟饘佼a(chǎn)生一定程度的響應(yīng)(見(jiàn)表3),其中,GPx是較為敏感的抗氧化指標(biāo),Cu2+[42-44,49]、Pb2+[49]、Hg2+[49]的暴露一般會(huì)抑制雙殼類(lèi)鰓和消化腺中GPx活性。Zn是生物生長(zhǎng)的1種必需微量元素,低濃度Zn2+(10 μmol/L,約為96 h LC50的1/10)暴露48 h,能夠明顯增加棕色貽貝(Perna perna)鰓的GPx活性,但是當(dāng)Zn2+濃度增加到30μmol/L、100μmol/L時(shí),同樣時(shí)間的暴露不再能夠誘導(dǎo)GPx活性,表明高濃度Zn2+在機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生了較多的自由基,無(wú)法進(jìn)行有效防御[51]。雙殼類(lèi)外套膜的GPx對(duì)金屬離子較不敏感:合浦珠母貝(Pinctada fucata)經(jīng)過(guò)0.03 mg/L的Cu2+暴露72 h[45],消化腺和鰓中GPx活性顯著低于對(duì)照組,而外套膜GPx活性則無(wú)明顯變化。

重金屬的暴露大多會(huì)造成雙殼類(lèi)動(dòng)物GSH含量降低和GSSG增加[46-47,52],這種變化比GST、CA T等抗氧化酶的響應(yīng)迅速。例如,當(dāng)棕色貽貝分別暴露于含Cd2+(0.2 mg/L)和Cu2+(0.04 mg/L)的海水時(shí),GSH含量在12和24 h已顯著低于對(duì)照,而CA T活性在暴露120 h后才顯著上升[52]。Dafre等[47]的研究同樣發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)1 mg/L的Pb2+暴露48 h,棕色貽貝消化腺的GSH含量降低、GSSG含量增加,而GST、CA T活性與對(duì)照組則沒(méi)有顯著差異。GSH雖能對(duì)重金屬快速響應(yīng),但是細(xì)胞自身趨于保持還原態(tài)GSH水平恒定的機(jī)制,使得暴露后期雙殼類(lèi)動(dòng)物GSH含量有所恢復(fù)甚至明顯增加[16,51-52],掩蓋了暴露初期GSH對(duì)重金屬的響應(yīng),降低了其對(duì)重金屬的敏感性,限制了其在重金屬生物監(jiān)測(cè)的應(yīng)用。

GR將GSSG再生為GSH,有利于保持細(xì)胞內(nèi)的-SH水平,因此,逆境條件下GR的誘導(dǎo)十分重要。然而,從室內(nèi)雙殼類(lèi)動(dòng)物的重金屬暴露研究看,只有Verlecar等[16]發(fā)現(xiàn)翡翠貽貝在0.045 m g/L Hg2+暴露5和15 d后,消化腺GR活性明顯增加,相應(yīng)地,GSH含量在暴露期間保持不變甚至上升。較多的研究發(fā)現(xiàn),海水重金屬(Cu2+、Zn2+等)能夠抑制紫貽貝消化腺[46]和棕色貽貝鰓[51]的GR活性。隨著重金屬暴露后GR活性的下降,GSH含量也不總是表現(xiàn)為同步降低,甚至?xí)忻黠@上升。這可能是因?yàn)橹亟饘偻ㄟ^(guò)誘導(dǎo)速控酶谷胺酸半胱氨酸連接酶(Glutamate cysteine ligase,GLC)促進(jìn)了GSH合成[51]。

GST雖然也能催化GSH與重金屬污染物之間的反應(yīng),但是,許多室內(nèi)研究表明,棕色貽貝[47,51]、紫貽貝[46]、櫛孔扇貝[49]等雙殼類(lèi)動(dòng)物消化腺和鰓中的GST對(duì)重金屬的短期暴露(48 h)和長(zhǎng)期暴露(1～3周)沒(méi)有產(chǎn)生任何明顯響應(yīng)。只有極個(gè)別研究發(fā)現(xiàn)[16],0.045 mg/L的Hg2+能夠誘導(dǎo)翡翠貽貝消化腺的GST活性,且需在暴露10 d后才能檢測(cè)到。

環(huán)境條件(溫度、鹽度、溶解氧、p H)和生物因子(動(dòng)物年齡、個(gè)體大小或發(fā)育階段、饑餓、病害等)的變化,都可能影響到生物體對(duì)重金屬的敏感性[53]。在污染海域現(xiàn)場(chǎng),這些因子的變化同樣也會(huì)影響到雙殼類(lèi)動(dòng)物抗氧化防御系統(tǒng)對(duì)重金屬的響應(yīng)程度,并與室內(nèi)受控條件下的研究結(jié)果存在一定差異。西班牙Colexio大學(xué)的Vidal-Linan等[54]對(duì)西班牙加利西亞沿海5個(gè)站位(其中3個(gè)位于重金屬污染嚴(yán)重的河口內(nèi),2個(gè)位于遠(yuǎn)離污染的河口外部)的紫貽貝進(jìn)行采樣分析發(fā)現(xiàn),貽貝組織中的GST活性與Cu(p<0.01,r2=0.76)、Zn(p<0.05,r2=0.40)含量顯著相關(guān),然而,GPx、CAT與貽貝中重金屬含量的相關(guān)性不顯著。另外一項(xiàng)研究對(duì)西班牙地中海沿岸16個(gè)站位紫貽貝鰓組織的生物標(biāo)志物和重金屬含量進(jìn)行測(cè)定,Pearson統(tǒng)計(jì)分析表明[23],GPx、GR和GST相互間表現(xiàn)為正相關(guān)性,且均與Hg、Pb、Cd含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系,GR還與Zn含量顯著正相關(guān),而SOD、CAT活性與Hg含量呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系;同時(shí)還發(fā)現(xiàn),As含量與各標(biāo)志物之間均不存在顯著相關(guān)性,原因可能是貽貝等海洋動(dòng)物主要吸收積累非毒性的有機(jī)態(tài)砷(特別是砷甜菜堿)而非生物毒性大的無(wú)機(jī)態(tài)砷[23],因而不能造成氧化逆境或過(guò)氧化損傷。西班牙科多巴大學(xué)的Rodriguez-Ortega等[55]對(duì)西班牙南部沿海地區(qū)7個(gè)站位的(Chamaelea gallina)軟組織中生物標(biāo)志物水平和9種重金屬含量進(jìn)行測(cè)定,并利用多元回歸法辨析與重金屬相關(guān)和無(wú)關(guān)的標(biāo)志物種類(lèi)。很多重金屬(Cr、Pb、Zn等)對(duì)生物標(biāo)志物表現(xiàn)出抑制效應(yīng),即呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,包括:As與GST、GSH和GPx,Cr與CAT,Zn與GSH,Pb與CAT、GSH;呈現(xiàn)顯著正相關(guān)的僅有Cr與GST、GR,Zn與GR;而SOD則與任何重金屬之間無(wú)顯著相關(guān)性。

表3 暴露于海水重金屬后雙殼類(lèi)GSH、GPx、GR、GST的響應(yīng)Table 3 Responses of GSH,GPx,GR and GST in several bivalves exposed to heavy metals in seawater

4 展望

國(guó)內(nèi)外已有的研究表明,MTs是重金屬的特異性MBM s,而HSP70以及SOD、CA T、GSH等均屬于非特異性MBM s。室內(nèi)暴露實(shí)驗(yàn)和海域現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查的結(jié)果證實(shí),雙殼類(lèi)動(dòng)物中的這些MBM s對(duì)海水中mg/L甚至μg/L數(shù)量級(jí)的重金屬能夠產(chǎn)生顯著響應(yīng),并存在一定的相關(guān)性,因而使其應(yīng)用于海水重金屬微污染的靈敏監(jiān)測(cè)成為可能。歐洲國(guó)際海洋勘察委員會(huì)(ICES)[56]已將這些MBM s作為海洋生態(tài)健康評(píng)價(jià)中指示重金屬污染的指標(biāo)。國(guó)外研究機(jī)構(gòu)(如美國(guó)國(guó)家海洋和氣象局NOAA[2]、ICES[56]等)近十年來(lái)致力于利用雙殼類(lèi)生物標(biāo)志物評(píng)價(jià)海洋環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)技術(shù)研究,主要進(jìn)行多種暴露途徑、多種化合物綜合影響的野外現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn),通過(guò)將清潔區(qū)雙殼類(lèi)生物以籠養(yǎng)方式移植到污染海域,實(shí)現(xiàn)“原位”指示污染狀況,并通過(guò)建立適宜的雙殼類(lèi)生物標(biāo)志物體系和計(jì)算生物標(biāo)志物響應(yīng)指數(shù)(BRI),實(shí)現(xiàn)海洋生態(tài)環(huán)境質(zhì)量的等級(jí)劃分和綜合評(píng)價(jià)。

相對(duì)而言,國(guó)內(nèi)起步相對(duì)較晚,尚處于實(shí)驗(yàn)室受控條件下單一暴露途徑的基礎(chǔ)研究階段,在重金屬的MBM s種類(lèi)上,主要集中在雙殼類(lèi)的抗氧化防御系統(tǒng)和MTs,而有關(guān)雙殼類(lèi)HSP70對(duì)海水重金屬暴露的響應(yīng)研究較少;在宏觀上,尚未很好地同野外實(shí)際狀況相結(jié)合;在微觀上,未能深入研究污染物的致毒機(jī)理。為了將雙殼類(lèi)動(dòng)物的MBM s更快更好地應(yīng)用于我國(guó)海域重金屬污染監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià),還需要在以下幾方面進(jìn)行廣泛而深入的研究。

(1)MBM s種類(lèi)的選擇。在海洋重金屬的生物監(jiān)測(cè)中,特異性MBM s和非特異性MBM s各有其重要作用,均應(yīng)受到重視。大多數(shù)MBM s是非特異性的,一般比較容易測(cè)定,也能夠?qū)Υ嬖谟诃h(huán)境中的復(fù)雜混合物產(chǎn)生響應(yīng),并提供指示環(huán)境擾動(dòng)而不是因果關(guān)系的信息,以滿足污染現(xiàn)狀概況評(píng)價(jià)的需要;MTs則適于重金屬存在的情況。在某一海域的污染監(jiān)測(cè)中,可首先采用經(jīng)濟(jì)、快速的非特異性MBM s,確定受人為活動(dòng)干擾大的位點(diǎn),而后進(jìn)一步采用成本高、費(fèi)時(shí)的MTs確定是否受到重金屬的污染。

(2)MBM s分析方法的規(guī)范化。每種MBM s可能有多種測(cè)定方法,為保證海洋重金屬生物監(jiān)測(cè)的經(jīng)濟(jì)、快速,應(yīng)選擇操作簡(jiǎn)便、容易測(cè)定、不需要復(fù)雜儀器設(shè)備的分析方法。對(duì)于選定的MBM s,應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量保證和質(zhì)量控制(QA/QC),以確保測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性和同一樣品在不同實(shí)驗(yàn)室的可重復(fù)性,包括:不同實(shí)驗(yàn)室所使用的生物標(biāo)志物的內(nèi)部校正;標(biāo)準(zhǔn)的操作方法(SOPs)的建立等。

(3)MBM s供體的標(biāo)準(zhǔn)化。雙殼類(lèi)MBM s對(duì)重金屬暴露的響應(yīng)受到生物種類(lèi)、性別、發(fā)育階段、組織器官種類(lèi)等生物學(xué)因子的影響。應(yīng)以國(guó)內(nèi)各海域分布廣泛的雙殼類(lèi)動(dòng)物作為研究材料,在室內(nèi)受控條件下,系統(tǒng)研究雙殼類(lèi)的種類(lèi)、性別、發(fā)育階段、組織器官種類(lèi)對(duì)重金屬暴露后MBM s響應(yīng)的影響,通過(guò)分析比較,確定作為提取MBM s的雙殼類(lèi)應(yīng)具備的生物特征,在區(qū)域或國(guó)家范圍內(nèi),規(guī)范統(tǒng)一由此保證生物標(biāo)志物供體的標(biāo)準(zhǔn)化。

(4)非生物因子對(duì)MBM s響應(yīng)的干擾。調(diào)查海域的環(huán)境因子(p H、溫度、鹽度、溶解氧等)不象室內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)菢涌梢院愣刂?其波動(dòng)將影響雙殼類(lèi)動(dòng)物生長(zhǎng)及其對(duì)重金屬的吸收積累,進(jìn)而干擾MBM s對(duì)重金屬的響應(yīng)程度[53],降低MBM s指示海水重金屬污染水平的準(zhǔn)確性。為此,應(yīng)通過(guò)室內(nèi)系統(tǒng)研究,辨析這些因子的不同水平對(duì)MBM s響應(yīng)的影響方向和大小,在此基礎(chǔ)上,確定干擾較大的環(huán)境因子,以便對(duì)現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用MBM s進(jìn)行監(jiān)測(cè)時(shí)的采樣季節(jié)和站位選擇提供指導(dǎo),使不同站位的采樣條件盡可能一致,降低非生物因子對(duì)MBM s指示重金屬污染程度的影響。

(5)深入研究海水背景下重金屬與雙殼類(lèi)MBM s之間的作用機(jī)理,有助于合理解析重金屬脅迫后各種MBM s的變化規(guī)律,以便客觀地評(píng)價(jià)重金屬的海洋生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)性。

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