劉 吉,蔡文娣,楊 艷**,劉萬順,韓寶芹,常 菁
(1.中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院,山東青島266003;2.濰坊醫(yī)學(xué)院,山東濰坊261042)
外源性毒物、藥物進(jìn)入體內(nèi),在肝臟中經(jīng)過肝臟代謝酶系統(tǒng)催化產(chǎn)生大量活性中間代謝物和自由基。肝臟既是藥物濃集、生物轉(zhuǎn)化、代謝的主要器官,又是機(jī)體代謝和免疫的重要器官,因此,藥源性肝疾病已成為中毒性肝損傷的重要原因。
谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是細(xì)胞內(nèi)重要的三肽化合物,是非蛋白類巰基的主要構(gòu)成成分,細(xì)胞內(nèi)90%以上的非蛋白結(jié)合巰基由GSH組成。GSH在體內(nèi)發(fā)揮重要抗氧化功能,它能使細(xì)胞免受各種有害物質(zhì),包括氧化劑、親電子物質(zhì)、異生性物質(zhì)等的傷害[1],當(dāng)GSH被大量清除時(shí)就會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷[2]。藥物經(jīng)肝臟代謝生成的親電子物質(zhì)及自由基均與GSH結(jié)合而滅活。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH的含量發(fā)生顯著變化,必須供給外源性GSH或者促進(jìn)體內(nèi)GSH的生物合成才能維持正常的機(jī)體功能。因此,維持谷胱甘肽含量穩(wěn)定具有重要意義。國內(nèi)外研究報(bào)道表明,L-半胱氨酸前體化合物能在體內(nèi)通過釋放出相應(yīng)的L-半胱氨酸,促進(jìn)GSH的合成,從而保護(hù)機(jī)體。其中,噻唑啉衍生物就是一類重要的L-半胱氨酸前體化合物。
本課題組研究合成了1種新的噻唑烷酸衍生物(GlcNAcCys),并對(duì)其體內(nèi)外抗氧化、提高巰基含量、保護(hù)高劑量撲熱息痛誘導(dǎo)的肝功能損傷進(jìn)行了研究。前期研究結(jié)果表明,GlcNAcCys具有較好的抗氧化活性,能夠清除自由基,保護(hù)生物大分子(蛋白質(zhì),脂質(zhì),脫氧核糖)免受自由基的損害[3];提高小鼠體內(nèi)巰基含量,保護(hù)高劑量撲熱息痛誘導(dǎo)的肝損傷[4]。但是Glc-NAcCys的作用機(jī)理有待于進(jìn)一步研究。丁胱亞磺酰亞胺(BSO)是GSH從頭合成抑制劑,可抑制GCL酶的活性,降低細(xì)胞內(nèi)GSH含量[5]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上利用BSO誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型進(jìn)一步研究了GlcNAcCys提高肝組織GSH含量的作用機(jī)制。
動(dòng)物:選用雄性昆明小鼠40只,體質(zhì)量18~22 g,購自青島實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SCXK(魯)20030010;
試劑:GCL、β-actin引物購自上海博尚生物技術(shù)有限公司;溴化乙錠(EB)、5,5’-二硫代雙-(2-硝基苯甲酸(D TNB)、GSH購自Sigma公司;DL 2000 marker、10×loading buffer、瓊脂糖購自Takara公司;牛血清白蛋白(BSA)購自北京拜爾迪生物公司;N-乙基馬來酰亞胺(NEM)購自天津市化學(xué)試劑研究所;鄰苯二甲醛(OPA)購自上海山浦化工有限公司;乙二胺四乙酸(EDTA)購自南京化學(xué)試劑有限公司;谷胱甘肽還原酶(GR)、谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶(GST)活性測(cè)定試劑盒購自南京建成生物工程研究所;肝組織總RNA提取試劑盒、DNA酶試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自天根生化科技有限公司。
紫外可見光分光光度計(jì),北京普析通用儀器有限公司產(chǎn)品;M IKRO 22R Hettich離心機(jī),上海捷惠科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;Bio-RAD power pactm-basic電泳儀及水平電泳槽,Bio-Rad公司產(chǎn)品;PCR儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;BT-232H5S凝膠成像系統(tǒng),上海培清科技有限公司產(chǎn)品;970CRT熒光分光光度計(jì),上?,F(xiàn)科分光儀器有限公司;Synchron CX-7全自動(dòng)生化分析儀,美國Beckman有限公司。
小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、BSO組和GlcNAcCys低、中、高劑量組,每組8只。正常對(duì)照組小鼠腹腔注射生理鹽水,BSO組及GlcNAcCys低、中、高劑量組小鼠腹腔注射BSO(6 mmol/kg體質(zhì)量)。注射BSO 2 h后,正常對(duì)照組和BSO組小鼠腹腔注射生理鹽水,Glc-NAcCys低、中、高劑量組小鼠分別腹腔注射GlcNAc-Cys,劑量分別為200、400和900 mg/kg體質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)6 h后,小鼠斷頸處死,分離肝組織,部分肝組織迅速液氮冷凍并于-80℃凍存,待提取組織總RNA,用RTPCR研究谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCL)基因表達(dá)情況。剩余肝組織,用冷生理鹽水沖洗后稱取0.5 g,放入勻漿器內(nèi),加5 m L Tris-HCl緩沖液(p H=7.4),制成10%的組織勻漿并取上清冷凍保存,待測(cè)肝臟中GR、GST活性以及總巰基(T-SH)、GSH含量。
1.4.1 肝勻漿中T-SH含量的測(cè)定 采用Ellman’s的測(cè)定方法進(jìn)行[6]。巰基和DTNB反應(yīng),在412 nm處有最大光吸收,412 nm處摩爾消光系數(shù)為13100。巰基含量以nmol/mg p rot表示。
1.4.2 肝勻漿中GSH含量的測(cè)定 參照P.J.Hissin等人的方法[7]進(jìn)行。利用在p H=8.0時(shí)GSH與鄰本二甲醛(OPA)結(jié)合可發(fā)熒光物質(zhì),從而對(duì)肝勻漿中GSH進(jìn)行定量測(cè)量。N-乙基馬來酰亞胺(NEM)用0.1 mol/L磷酸鈉含0.005 mol/L ED TA的緩沖液(p H=8.0)配制,GSH標(biāo)準(zhǔn)物用偏磷酸配制,每日制備新鮮原液(1 mg/mL),用前稀釋至所需濃度。鄰苯二甲醛(OPA)溶液,用分析純無水甲醇每日新鮮制備。取100μL肝勻漿加入100μL NEM,30 min后加入100μL OPA熒光試劑,充分混合,室溫放置15 min后,在熒光分光光度計(jì)上設(shè)置激發(fā)波長334 nm,發(fā)射波長420 nm,測(cè)定熒光強(qiáng)度。GSH濃度用μg/mg蛋白表示。
1.4.3 肝勻漿中GR、GST活性的測(cè)定 分別取300 μL小鼠肝勻漿液,并按血清及組織中GR、GST測(cè)定試盒中的操作步驟進(jìn)行。GR活力定義為:每克組織蛋白每分鐘使反應(yīng)體系中底物NADPH的濃度改變1 mmol/L所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。GST活力定義為:扣除非酶促反應(yīng),每毫克組織蛋白,在37℃反應(yīng)1 min使反應(yīng)體系中GSH濃度降低1μmol/L為1個(gè)酶活力單位。
1.4.4 肝勻漿液中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 參照Low ry等[8]的方法進(jìn)行,從牛血清白蛋白(BSA)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出肝勻漿中蛋白質(zhì)的濃度。
1.4.5 肝組織GCL m RNA表達(dá) 肝臟總RNA的提取、DNA酶的去除、RNA的純化、逆轉(zhuǎn)錄以及PCR反應(yīng)均按照試劑盒中的操作步驟進(jìn)行。
總RNA的提取及純化:按照試劑盒中的操作依次進(jìn)行總RNA提取、DNA酶去除、RNA純化,純化后的RNA樣品,采用紫外分光光度法測(cè)定其在260和280 nm的紫外吸收值。根據(jù)OD260/OD280光密度值定量判定RNA樣品的純度,并用電泳法鑒定其分子完整性。根據(jù)260 nm處1 OD光吸收值相當(dāng)于40μg/m L RNA確定逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)時(shí)RNA的用量。
逆轉(zhuǎn)錄:取純化后的RNA,利用Olig(d T)反逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,體系包括(總體積為20μL):Olig(d T)2μL,2.5 mmol/LdN TPs 2μL,總RNA 3μg,Rnasefree H2O補(bǔ)足體積至13.5μL,70℃反應(yīng)5 min后迅速在冰上冷卻2 min。然后加入5×First-Strand Buffer 4μL,0.1mol/LDTT 1μL,Rnasin 0.5μL,逆轉(zhuǎn)錄酶TIANScrip t M-MLV 1μL,42℃反應(yīng)50 min,95℃加熱5 min終止反應(yīng)。
PCR反應(yīng):利用GCL正反引物A GA CAC GGC A TC CTC CAG TT(正向)和CTG ACA CGT AGC CTC GGT AA(反向)(見表1),以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)肝組織GCL m RNA的表達(dá)。PCR反應(yīng)條件如下:逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3.5μL;正向、反義鏈引物各1μL;2×Master M ix 12.5μL;ddH2O補(bǔ)足25μL。混勻,高速離心10 s后置于PCR儀中開始PCR反應(yīng),反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性5 min;94℃30 s;55℃30 s;72℃30 s;30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。
表1 大鼠GCL序列擴(kuò)增與檢測(cè)所用寡核苷酸引物[9]Table 1 Oligonucleotide p rimers for the amp lification and detection of rat GCL
電泳結(jié)果分析:配制1.5%的瓊脂膠(含溴化乙錠0.5μg/mL),產(chǎn)物、β-actin和DL 2000各上樣3μL,200 V電泳30 min,紫外燈下觀察照片。
結(jié)果計(jì)算:電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進(jìn)行電泳條帶光密度分析。某標(biāo)本靶基因條帶光密度與內(nèi)參基因(β-actin)條帶的光密度之比值作為該標(biāo)本m RNA的表達(dá)水平。
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為M ean±S.D.。所有組間差異顯著性分析用SPSS 11.0軟件中Dunnett’s t檢驗(yàn)進(jìn)行處理,以P<0.05為具有顯著性差異。
結(jié)果見圖1。BSO組小鼠腹腔注射BSO后,肝組織T-SH含量顯著降低。與正常對(duì)照組相比,肝臟TSH的含量降低了40%(P<0.05)。GlcNAcCys能夠提高肝組織T-SH含量,其中低劑量組作用效果最顯著,肝T-SH含量升高至BSO組的2.14倍(P<0.05)。
圖1 GlcNAcCys對(duì)肝勻漿中T-SH含量的影響Fig.1 Effects of GlcNAcCys on liver homogenate T-SH content
GSH濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。
GlcNAcCys對(duì)肝勻漿中GSH含量的影響見圖3。從圖3中可以看出,BSO組GSH含量顯著降低,與正常對(duì)照組相比,GSH含量降低了29%。GlcNAcCys(200 m g/kg體質(zhì)量)能夠顯著提高GSH含量,與BSO組比較,GSH含量提高了40%。
圖2 GSH濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for GSH concentration
圖3 GlcNAcCys對(duì)肝勻漿中GSH含量的影響Fig.3 Effect of GlcNAcCyson liver homogenate GSH content
結(jié)果見圖4。腹腔注射BSO對(duì)肝勻漿GR活性沒有顯著影響。低劑量GlcNAcCys能夠顯著提高GR活性,GR活性與BSO組相比提高了43%,與正常對(duì)照組相比提高了54%。
圖4 GlcNAcCys對(duì)肝勻漿中GR活性的影響Fig.4 Effectsof GlcNAcCys on liverhomogenate GR activities
結(jié)果見圖5。從圖5中可以看出BSO能夠抑制GST活性。與正常對(duì)照組比較,BSO組GST活性降低了33%。GlcNAcCys各劑量組GST活性均高于BSO組,其中低劑量組GST活性提高至BSO組的2.3倍(P<0.05)。
圖5 GlcNAcCys對(duì)肝勻漿中GST活性的影響Fig.5 Effectsof GlcNAcCys on liver homogenate GST activities
1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA純度結(jié)果見圖6。28 S熒光亮度約為18 S的2倍,無其它大分子條帶,表明總RNA無蛋白污染,無降解。經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)顯示,260/280的比值介于1.8~2.0之間,純度符合要求。
圖6 肝臟總RNA抽提結(jié)果Fig.6 Result of liver to tal RNA extraction
BSO、GlcNAcCys對(duì)大鼠肝臟GCL m RNA表達(dá)的影響見圖7。RT-PCR結(jié)果顯示小鼠腹腔注射BSO后,與正常對(duì)照組相比較,肝組織GCL m RNA表達(dá)量沒有發(fā)生明顯變化,提示BSO降低肝臟GSH含量與抑制GCL m RNA表達(dá)無關(guān),BSO可能通過其他途徑降低肝臟GSH含量。GlcNAcCys(400、900 mg/kg體質(zhì)量)能夠誘導(dǎo)GCL m RNA表達(dá)。
圖7 肝臟GCLm RNA表達(dá)的變化Fig.7 Effects of GlcNAcCys on GCL m RNA expression
單糖的醛基能夠和半胱氨酸的-SH和-NH2發(fā)生環(huán)縮合反應(yīng),生成噻唑烷酸衍生物,噻唑烷酸衍生物可作為L-半胱氨酸的前體化合物,通過非酶解的開環(huán)水解反應(yīng)逐漸釋放出L-半胱氨酸和相同摩爾的糖基。釋放出的L-半胱氨酸在體內(nèi)能夠促進(jìn)谷胱甘肽的從頭生物合成,發(fā)揮抗氧化作用,保護(hù)機(jī)體。關(guān)于噻唑烷酸糖衍生物的抗氧化功能已有過報(bào)道,左旋-2-氧-4-羧噻唑烷作為半胱氨酸的前體,可增加GSH的合成[10]。Lang CA等發(fā)現(xiàn)羧酸噻唑烷鎂(Mg TC)能大大提高果蠅、蚊子、小鼠的GSH含量,延長壽命[11]。William son等報(bào)道,L-2-氧-4-噻唑烷酸能明顯升高小鼠肝組織的GSH水平,恢復(fù)過量撲熱息痛中毒小鼠肝組織的GSH水平[12]。本文在前期研究的基礎(chǔ)上,利用BSO降低小鼠肝GSH含量動(dòng)物模型研究了GlcNAcCys對(duì)肝臟T-SH、GSH含量和抗氧化酶(GST、GR)活性的影響及相應(yīng)機(jī)制。
BSO是GSH合成強(qiáng)有力的抑制劑,Sen CK等給大鼠注射BSO(6 mmol/kg體質(zhì)量)后,肝臟、肺、血漿總GSH含量下降50%,骨骼肌、心臟總GSH下降80%~90%[13]。本文研究結(jié)果顯示小鼠腹腔注射BSO后,肝勻漿中T-SH及GSH含量顯著降低,表明肝臟GSH耗竭動(dòng)物模型建立成功。
巰基是體內(nèi)重要的還原性基團(tuán),能夠清除自由基,具有重要的解毒功能。細(xì)胞內(nèi)的總巰基(T-SH)主要包括兩類,一類為蛋白巰基(PB-SH),是多種酶的活性中心。一類是非蛋白巰基(NP-SH),90%以上由還原型谷胱甘肽(GSH)組成。GSH是體內(nèi)重要的小分子物質(zhì),它能使細(xì)胞免受各種有害物質(zhì),包括氧化劑、親電子物質(zhì)、異生性物質(zhì)等的傷害,能減輕機(jī)體由于上述物質(zhì)導(dǎo)致的炎癥反應(yīng),同時(shí)還有提高機(jī)體抗氧化能力的作用。從本研究中可以看出,BSO可降低肝臟TSH、GSH含量。肝臟是機(jī)體重要的解毒器官,GSH含量降低將使肝臟更容易受到各種毒性中間代謝物的損傷。GlcNAcCys能夠顯著提高肝臟T-SH、GSH含量,使T-SH、GSH含量趨于穩(wěn)定。GlcNAcCys在體內(nèi)可以通過水解,釋放半胱氨酸,進(jìn)而促進(jìn)GSH的合成,維持細(xì)胞處于還原狀態(tài),使以巰基為活性中心的酶處于活性狀態(tài),提高組織的抗氧化能力。
GR是1種黃素酶,可催化氧化型谷胱甘肽轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原型谷胱甘肽,增加細(xì)胞液中還原型谷胱甘肽的含量,有抵抗自由基氧化對(duì)機(jī)體損傷的作用。GST是肝臟Ⅱ相代謝反應(yīng)中重要的轉(zhuǎn)移酶,可催化外源毒物、藥物在肝臟的代謝。GST能夠催化還原型谷胱甘肽與一系列親電子化合物(包括各種致癌物)結(jié)合成無毒的結(jié)合物排出體外,從而發(fā)揮解毒功能[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低劑量GlcNAcCys(200 m g/kg)可顯著提高肝臟GR的活性,催化谷胱甘肽由氧化型變?yōu)檫€原型,從而提高GSH含量,增強(qiáng)肝臟抗氧化能力;腹腔注射GlcNAc-Cys(200 m g/kg)能顯著誘導(dǎo)GST的活性,增強(qiáng)肝臟的解毒功能,保護(hù)肝臟免受外源化合物代謝產(chǎn)生的毒性中間代謝物的損傷。
谷氨酰-L-半胱氨酸連接酶(glutamyl-L-cysteine ligase,GCL),是GSH從頭合成過程第一步反應(yīng)的催化酶,也是GSH從頭合成的限速酶,GCL酶活的調(diào)節(jié)可在基因轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯后水平等環(huán)節(jié),主要在基因轉(zhuǎn)錄水平[15]。Kitteringham NR等[16]報(bào)道,BSO對(duì)小鼠肝臟GCL m RNA水平和蛋白水平?jīng)]有影響。本研究結(jié)果顯示,BSO組與正常對(duì)照組相比,GCL基因表達(dá)沒有顯著差異。當(dāng)GSH含量低于正常水平時(shí),GlcNAcCys(400,900 mg/kg)能顯著誘導(dǎo)GCL基因的轉(zhuǎn)錄。這一結(jié)果表明,GlcNAcCys提高GSH含量的功能可能與其誘導(dǎo)GCL m RNA表達(dá)有關(guān)。而200 mg/kg GlcNAcCys劑量組GSH含量升高的同時(shí),GCL m RNA表達(dá)受到抑制,這可以從兩方面來解釋:第一,GCL基因表達(dá)的誘導(dǎo)是控制GSH合成,維持GSH含量穩(wěn)定的重要途徑,但是,機(jī)體內(nèi)可能存在一種“初始生化應(yīng)答反應(yīng)”來調(diào)節(jié)GSH的合成[17]。第二,GCL m RNA表達(dá)受細(xì)胞內(nèi)GSH含量的影響,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)GSH增多時(shí),減少了GCL重、輕鏈間的二硫健連結(jié),從而引起反饋調(diào)節(jié),抑制GCL的表達(dá)[18]。
總之,GlcNAcCys能夠提高肝組織T-SH、GSH含量,增強(qiáng)GST、GR酶活力,提高肝臟的抗氧化能力和解毒功能,保護(hù)肝臟免受毒性中間代謝物的損傷。GlcNAcCys提高肝臟T-SH、GSH含量的機(jī)制可能與其誘導(dǎo)GCL m RNA的表達(dá)有關(guān)。
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