盧孔旭

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310032）

牛蒡子為菊科草本植物牛蒡（Arctium lappl L.）的干燥成熟種子，是我國廣泛運(yùn)用的傳統(tǒng)中藥［1］。藥理學(xué)等多項(xiàng)研究表明，牛蒡子中的主要活性成分是牛蒡子苷和牛蒡子苷元［2-5］。然而，牛蒡子中牛蒡子苷的含量只有3％～5％。牛蒡子苷元在牛蒡子中的含量更少，平均含量約為0.19％［6］。由于牛蒡子苷和苷元極性很大，需要用高極性溶劑提?。?］，此外也有些其他方法見文獻(xiàn)報(bào)道如采用超臨界流體［8］和超聲波輔助提取法［9］提取。溶劑提取以其方便易處理，有利于工業(yè)化應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)受到天然藥物提取的青睞。本研究選擇牛蒡子為原材料，通過不同極性溶劑的提取率來合理選擇提取和分離溶劑，采用正交實(shí)驗(yàn)方法，確定溶劑對(duì)牛蒡子提取的最佳條件，并通過硅膠柱層析分離純化得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元。以期得到合理便捷的提取和純化的方法開發(fā)制備從天然牛蒡子中提取和純化牛蒡子苷和牛蒡子苷元藥物。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 材料

牛蒡子干燥果實(shí)購置于杭州胡慶余堂。牛蒡子苷及牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品購置于上海博蘊(yùn)生物技術(shù)有限公司。柱層析硅膠100～200目，TLC法用硅膠G，購于青島海洋化工。其他試劑如甲醇、乙醇、石油醚、乙醚、丙酮、氯仿、二氯甲烷等均為市售分析純。

1.2 主要儀器

安捷倫高效液相色譜1200。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 牛蒡子苷和牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

稱取牛蒡子苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100mL無菌水中，分別配置成0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mmol/L的牛蒡子苷溶液；稱取牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)品溶解于100mL無菌水中，分別配置成0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mmol/L的牛蒡子苷元溶液。

1.3.1.2 色譜條件

色譜柱為Aglient Eclipse XDB-C8（4.6mm×150mm×5μm）。

檢測(cè)條件：甲醇∶水=1∶1.1，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長280nm，進(jìn)樣量10μL，柱溫30℃。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度（mmol/L）為橫坐標(biāo)，液相色譜的相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，按1.3.1.2的色譜條件進(jìn)樣。根據(jù)HPLC方法測(cè)定結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w得到：牛蒡子苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=83.616X+17.785，R2=0.99983，牛蒡子苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=24.776X+13.241，R2=0.99987。在一定的濃度范圍內(nèi)其線性相關(guān)性較好。

1.3.2 牛蒡子苷及牛蒡子苷元的提取

1.3.2.1 提取溶劑的選擇

稱取10g牛蒡子粉末，石油醚脫脂后，分別用80mL的乙醚，丙酮，80％乙醇和甲醇進(jìn)行回流提取，提取3次，每次1h。合并3次的提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后，刮下燒瓶里的浸膏進(jìn)行稱量。將得到的浸膏烘干后，分別稱取0.1g，用100mL甲醇定容，制成1mg/mL的待測(cè)溶液。按1.3.1.2的HPLC條件，分別對(duì)乙醚、丙酮、乙醇、甲醇提取物進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.2.2 提取工藝條件的優(yōu)化

以乙醇濃度，回流時(shí)間，回流次數(shù)和乙醇用量作為考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，以牛蒡子苷提取率為考察指標(biāo)，做正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交因素水平選擇表

1.3.2.3 牛蒡子的粗提

稱取100g的牛蒡子粉末，用80％的乙醇回流，回流時(shí)間為1h，每次8倍劑量乙醇，回流3次，合并醇提液后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，得到的浸膏用二氯甲烷萃取1h，萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后得到牛蒡子的粗提物。

1.3.2.4 硅膠柱層析

將牛蒡子粗提物溶于一定量的二氯甲烷后，濕法上樣，用二氯甲烷：甲醇（20∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇（4∶4∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯（5∶4，v/v）梯度洗脫。用HPLC測(cè)定牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取溶劑的選擇

分別采用乙醚、丙酮和80％乙醇及甲醇作為提取溶劑得到浸膏的量以及通過HPLC檢測(cè)得到的牛蒡子苷和牛蒡子苷元的含量結(jié)果如表2所示。

表2 不同提取溶劑檢測(cè)結(jié)果 mg

對(duì)比分析以上的結(jié)果可以看出，乙醇和甲醇提取的出膏率比較高，而且乙醇和甲醇溶劑更有利于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的提取。甲醇溶劑的提取能力和乙醇近似，但由于考慮到甲醇的毒性較大，所以最后選擇乙醇作為提取溶劑。

2.2 提取工藝條件的優(yōu)化

以牛蒡子苷提取率為考察指標(biāo)，采用L9（43）正交實(shí)驗(yàn)對(duì)牛蒡子苷的提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。

表3 正交試驗(yàn)及結(jié)果分析

從表3中可以看出，4個(gè)因素中，回流次數(shù)對(duì)醇提工藝影響最大，其次是回流時(shí)間，乙醇濃度再次之。由分析可知，乙醇濃度為80％，回流時(shí)間為1h，提取次數(shù)為3次，乙醇劑量為80mL為最佳提取條件。

2.3 牛蒡子苷和苷元的提純

2.3.1 牛蒡子的粗提

牛蒡子粉末用80％的乙醇回流，回流時(shí)間為1h，每次8倍劑量乙醇，回流3次，合并醇提液后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，得到的浸膏用二氯甲烷萃取1h，萃取液經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，最后得到牛蒡子的粗提物。

2.3.2 硅膠柱層析提取純化效果

將牛蒡子粗提物溶于一定量的二氯甲烷后，濕法上樣，用二氯甲烷：甲醇（20∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯∶甲醇（4∶4∶1，v/v），二氯甲烷∶乙酸乙酯（5∶4，v/v）梯度洗脫。經(jīng)過硅膠層析純化后的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后得到牛蒡子苷和牛蒡子苷元的白色粉末，經(jīng)HPLC檢測(cè)，牛蒡子苷和牛蒡子苷元的純度。結(jié)果表明其中牛蒡子苷和牛蒡子苷元的純度分別達(dá)到95.5％和94％。這說明了采用硅膠層析方法可以對(duì)牛蒡子中的苷和苷元進(jìn)行有效的分離純化。

3 結(jié)論

由于牛蒡子苷和苷元極性很大，需要用高極性溶劑提取。采用乙醇回流提取牛蒡子的方法簡單方便，能最大程度的提取出牛蒡子中的苷和苷元。硅膠柱層析對(duì)于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的初提物的提取分離效果較好，適合用于牛蒡子苷和牛蒡子苷元的提取和純化。

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