牛建峰, 高勝寒, 駱迎峰, 袁 野, 王廣策, 胡松年

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 北京基因組研究所, 北京 100029)

條斑紫菜低覆蓋度基因組草圖分析

牛建峰1, 高勝寒2, 駱迎峰2, 袁 野2, 王廣策1, 胡松年2

(1. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院 北京基因組研究所, 北京 100029)

對條斑紫菜(Porphyrayezoensis)進(jìn)行Solexa高通量測序, 獲得低覆蓋度全基因組草圖。該基因組草圖大小約220 Mbp, GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)53.08%; 包含26 629個預(yù)測基因, 其中16 409個基因具有內(nèi)含子,平均每個基因含2.22個內(nèi)含子; 基因結(jié)構(gòu)分析表明具有內(nèi)含子的基因平均長度為2 214 bp, 內(nèi)含子平均大小319 bp; 代謝通路分析表明嘌呤代謝是含有蛋白數(shù)量最多的代謝途徑。本研究所得條斑紫菜低覆蓋度全基因組草圖快速獲取了基因組大小和蛋白編碼基因結(jié)構(gòu)等基本信息, 證明了使用Solexa高通量測序技術(shù)對條斑紫菜進(jìn)行全基因組測序的可行性。

條斑紫菜(Porphyra yezoensis); Solexa高通量測序; 代謝通路

紫菜屬(Porphyra)屬于紅藻門(Rhodophyta), 原紅藻綱(Rhodophyceae), 紅毛菜目(Bangiales), 紅毛菜科(Bangiaceae)。全世界已發(fā)現(xiàn)的紫菜約130余種,廣泛分布于寒帶至亞熱帶的潮間帶水域, 其中30種分布于北大西洋沿岸的歐美國家, 28種來自于日本,27種來自于太平洋沿岸的美國和加拿大, 中國特有種為壇紫菜, 除此之外, 在印度沿岸亦有報(bào)道[1]。紫菜屬物種外形簡單, 葉狀體從圓形、卵圓形至長條狀,長度5～35 cm。單個葉狀體上又有雌性區(qū)與雄性區(qū)的分別, 葉片呈單層或雙層細(xì)胞, 每個細(xì)胞含有一個或兩個具有淀粉核(或蛋白核)的星狀質(zhì)體。所有種的紫菜均具有孢子體和配子體的異型世代交替生活史[2]。

紫菜是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的大型海藻, 據(jù)統(tǒng)計(jì), 每年紫菜總產(chǎn)值高達(dá) 20億美元, 約占全世界大型海藻總產(chǎn)值的一半[3-5]。目前, 中國的紫菜栽培業(yè)發(fā)展迅速, 2001年后產(chǎn)量一直居世界第一, 已成為中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)[6-7]。其中條斑紫菜(Porphyra yezoensis)是栽培面積最大、經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的種類之一。由于經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 在其生活史、生態(tài)學(xué)、生理和生化等方面已被進(jìn)行了大量研究[8]。近年來,隨著紫菜栽培規(guī)模不斷擴(kuò)大和遺傳育種研究的需要,紫菜分子遺傳學(xué)研究應(yīng)運(yùn)而生。其中, 建立在 PCR基礎(chǔ)上的隨機(jī)擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA, RAPD)標(biāo)記技術(shù)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism,AFLP)標(biāo)記技術(shù)和簡單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSR)標(biāo)記技術(shù)在紫菜遺傳多樣性和分子系統(tǒng)學(xué)研究中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。

目前, 雖然已經(jīng)從紫菜中克隆到了一些生理調(diào)控基因, 但仍有大量的基因未被分離鑒定出來[9], 截止到2010年10月, 在GenBank中收錄的條斑紫菜的蛋白質(zhì)序列(不包括EST序列)約931個, 尚不能充分了解紫菜的分子遺傳學(xué)信息[10]。

建立在cDNA文庫以及序列測定基礎(chǔ)上的EST分析和基因序列的比較是當(dāng)前紫菜功能基因組學(xué)研究的主要手段。迄今為止, 國內(nèi)外研究者已經(jīng)先后建立了條斑紫菜孢子體和配子體以及壇紫菜絲狀孢子體的 cDNA文庫[11-17], 并在此基礎(chǔ)上對 cDNA克隆進(jìn)行測序進(jìn)而獲得EST序列。目前, 在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中可以找到22 069條條斑紫菜絲狀藻絲孢子體和配子體的EST[9,12-13]。對3267個非冗余EST序列的同源比較分析結(jié)果顯示, 約占分析序列 33.1%的EST序列與其他生物如高等植物、哺乳動物、酵母以及藍(lán)細(xì)菌等相似, 其余的則為首次發(fā)現(xiàn)。但限于分析規(guī)?；蜓芯磕繕?biāo)的限制, 大部分序列測定的數(shù)量都十分有限, 還沒有實(shí)質(zhì)性開展包括多個生長發(fā)育時期的大規(guī)模EST測序研究。

目前, 紫菜分子生物學(xué)的相關(guān)研究結(jié)果較分散,缺乏系統(tǒng)性。因此有必要對其遺傳背景進(jìn)行更廣泛和深入的系統(tǒng)研究, 從而更好地利用紫菜豐富的遺傳資源。與陸地植物相比, 海洋藻類基因組學(xué)研究還剛剛起步, 海藻功能基因的比較基因組學(xué)研究尚未見報(bào)道。本文使用第二代高通量測序儀Solexa對條斑紫菜進(jìn)行低覆蓋度全基因組測序, 獲取了條斑紫菜基因組大小和蛋白編碼基因大小、內(nèi)含子數(shù)量和大小等基因組基本特征, 為構(gòu)建高質(zhì)量條斑紫菜基因組精細(xì)圖作了準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 材料

條斑紫菜由江蘇蘇東海洋生物科技有限公司提供。

1.2 Solexa基因組文庫構(gòu)建和測序

提取高質(zhì)量紫菜基因組 DNA(天根新型植物基因組 DNA 提取試劑盒, DP320-02, 北京)。采用Covaris? S2 Covaris? Inc.)超聲儀進(jìn)行片段化。起始量 10 μg, 用 1×low TE Buffer稀釋到 300 mg/L, 參數(shù)設(shè)定如下, 20次循環(huán)×40 s, 水浴溫度： 5℃, 占空比：10%, 強(qiáng)度： 8, 模式： Frequency sweeping。

采用NEB Next DNA Sample Prep Reagent Set1(New England biolabs Inc.)進(jìn)行末端補(bǔ)平, 3′末端單堿基“A”加尾, Solexa測序 adapter連接和PCR富集。所有純化步驟采用 QIAGEN公司產(chǎn)品。末端補(bǔ)平：100 μL 反應(yīng)體系中, 50 μL 超聲打斷產(chǎn)物, 10 μL 10*Phosphorglation Buffer, 4μL 10*DNTP Mix (10 mmol), 5 μL T4 DNA Polymerase, 1 μL DNA Polymerase 1 (Large Fragmert), 5 μL T4 Polynucleotide Kinase, 20℃ 30 min, QIAquick PCR purification Kit純化。末端“A”加尾, 50 μL 反應(yīng)體系中, 32 μL 末端補(bǔ)平純化產(chǎn)物, 5 μL NEB Buffer2 (Klenow exo-),10 μL DATP 緩沖液 (1mmol), 3 μL Klenow Fragment(3′-5′exo-), 37℃ 30 min, QIAgen MinElute PCR Purification Kit純化。Solexa測序 adapter連接： 40 μL 反應(yīng)體系中, 19 μL加尾純化產(chǎn)物, 25 μL Quick Ligation Reaction Buffer, 1 μL, PE adapter Oligo Mix (100 μmol), 5 μL T4 DNA Ligase, 室溫放置 30 min,QIAgen MinElute PCR Purification Kit純化。連接產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離, 切取300～400 bp片段, QIAquick Gel Extraction Kit純化。PCR 富集： 60 μL體系, 25 μL PCR Mix (DNTP, buffer, 酶), 2 μL Solexa 擴(kuò)增Primer Mix (50 pmol), 33 μL膠回收產(chǎn)物,充分混合, PCR反應(yīng)條件： 98℃ 30 s; 98℃ 10 s, 65℃30 s, 72℃ 30 s, 10 個循環(huán); 72℃ 5 min。QIAquick PCR purification Kit純化。純化產(chǎn)物 NanoDrop? ND-1000 (Thermo Scientific Inc.)定量后按照Solexa測序儀標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行2×81雙向測序[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和拼接

根據(jù) Solexa序列質(zhì)量值, 去除兩個或兩個以上連續(xù)低質(zhì)量堿基(Q值小于20), 只保留長度大于35 bp的序列。SOAPdenovo (v1.04, BGI)[19]對高質(zhì)量Solexa序列進(jìn)行拼接, 參數(shù)設(shè)定為： K-mer長度29bp, 文庫平均插入長度300 bp, scaffolding聯(lián)配長度35 bp, 其余參數(shù)默認(rèn)。拼接完成后使用 gapcloser程序進(jìn)行scaffold內(nèi)部空洞填補(bǔ)。

1.3.2 基因組草圖覆蓋率評價(jià)

NCBI中條斑紫菜EST序列(2010年9月30日),共計(jì)22 069條[12], 對EST序列進(jìn)行blat[20]自我比對,去除相似性 95%且聯(lián)配比例大于 95%的冗余序列,得到非冗余EST序列15 517條,總長度7 012 808 bp。NCBI 中920條斑紫菜蛋白序列去冗余后得328條,平均長度277 aa。

統(tǒng)計(jì)NCBI中條斑紫菜EST和蛋白序列在contig或 scaffold上的覆蓋情況評價(jià)本研究所得基因組草圖的完整性。比對程序?yàn)閎lat[20], 只統(tǒng)計(jì)相似性大于95%且查詢序列覆蓋度大于10%的比對結(jié)果。對一條EST或蛋白序列被比對到多處基因組的情況, 只統(tǒng)計(jì)覆蓋度最高的比對結(jié)果。

1.3.3 基因預(yù)測

使用 augustus程序[21]中自帶的模型訓(xùn)練模塊對NCBI數(shù)據(jù)庫中已知紫菜屬基因的 CDS序列進(jìn)行訓(xùn)練, 生成基因預(yù)測模型, 并參考條斑紫菜已知 EST數(shù)據(jù)(22 069條), 對scaffold序列進(jìn)行預(yù)測。

使用exonerate程序[22]中的protein2genome模塊,將條斑紫菜已知蛋白標(biāo)注到條斑紫菜基因組上, 并設(shè)定長度覆蓋大于90%且得分最高的蛋白作為“成功exonerate蛋白”。預(yù)測基因與“成功 exonerate蛋白”進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)比較, 檢查augustus預(yù)測效果。

1.3.4 基因注釋

預(yù)測基因BLAST比對NCBI nr蛋白庫進(jìn)行初步注釋。定義BLAST比對E值小于1e-10, 且被比對蛋白長度覆蓋度大于90%的對應(yīng)條斑紫菜基因?yàn)椤叭L基因”。預(yù)測基因BLAST比對KEGG數(shù)據(jù)庫[23]進(jìn)行代謝途徑分析, 比對參數(shù)設(shè)定E小于1e-10。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理和拼接

質(zhì)量過濾后共得55 749 075條總計(jì)4 171 821 694 bp高質(zhì)量序列。SOAPdenovo程序拼接并根據(jù)序列正反向和文庫大小信息構(gòu)建scaffold和填補(bǔ)序列空洞, 結(jié)果得到長度587 042個大于100 bp的contig, 總長170 619 909 bp, N50值401 bp, 平均GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)53.08%, 最大contig 44 754 bp; 370 119個scaffold總長220 854 049 bp, N50值1 317 bp, 最大scaffold 236 183 bp。

2.2 條斑紫菜基因組草圖覆蓋率評價(jià)

非冗余EST序列比對contig序列結(jié)果顯示 (表1)： 共有 14 341條 EST 比對到 contig, 占總數(shù)的92.42%; 7 198條EST 90%以上序列被單個contig覆蓋, 比例為 46.39%, 50%以上長度被覆蓋的條數(shù)為12 163條, 比例為 78.38%。非冗余 EST序列比對scaffold結(jié)果顯示, 共計(jì)14 307 (92.20%)條EST比對到scaffold; 10 852條EST 90%以上被單個scaffold覆蓋, 比例為69.93%, 50%以上長度被覆蓋的條數(shù)為13 288條, 比例為85.63%。

表1 以已知條斑紫菜EST序列評價(jià)基因組草圖完整性Tab. 1 Assessment the sequence coverage of P. yezoensis genomic draft using known ESTs

非冗余條斑紫菜蛋白序列比對contig結(jié)果(表2)顯示： 299個可定位到contig上, 占非冗余蛋白序列的91.16%。單個蛋白90%以上長度被單個contig覆蓋的個數(shù)為171個, 比例為52.13%; 50%以上長度被單個 contig覆蓋的個數(shù)為 228個, 比例為69.51%。298個非冗余蛋白比對到 scaffold, 占非冗余蛋白序列的 90.85%。單條蛋白有 90%以上長度被單個scaffold覆蓋的個數(shù)為192個, 比例為58.54%; 50%以上長度被覆蓋的個數(shù)為233個, 比例為71.04%。

表2 以已知條斑紫菜蛋白序列評價(jià)基因組草圖完整性Tab. 2 Assessment the sequence coverage of P. yezoensis genomic draft using known proteins

條斑紫菜非冗余EST和全長已知蛋白序列覆蓋度分析表明 90%以上長度定位到基因組草圖的比例相對較低 (50%左右), 說明本草圖至少完整覆蓋了條斑紫菜基因組中全部編碼編碼基因中的一半, 并且總數(shù)90%以上的EST或蛋白序列可定位到基因組草圖上, 表明隨著 Solexa測序量的增加可以得到絕大多數(shù)完整基因序列。

2.3 基因預(yù)測

結(jié)果表明, 條斑紫菜基因組 augustus預(yù)測得26 629個“預(yù)測基因”, 總長43 407 556 bp, 平均長度1 624 bp, 編碼區(qū)平均長度為1 187 bp, 其中具有內(nèi)含子的基因16 409個, 占61.62%, 平均長度2 214 bp,平均每個基因含 2.22個內(nèi)含子, 內(nèi)含子平均長度319 bp。

exonerate結(jié)果表明, 328條非冗余紫菜蛋白序列中, 241條以≥90%蛋白長度比對到條斑紫菜基因組(稱為“exonerate蛋白”), 平均長度 938 bp; 其中 78個基因帶內(nèi)含子, 占總數(shù)的32.37%, 平均長度1 747 bp, 內(nèi)含子平均長度 260 bp, 平均每個基因含 1.89個內(nèi)含子。所以從基因結(jié)構(gòu)上看, 預(yù)測基因和已知條斑紫菜蛋白基本相同, 由此說明了 augustus軟件進(jìn)行基因預(yù)測的合理性。

2.4 基因注釋

26 629條預(yù)測蛋白BLAST比對NCBI非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫(nr),E值小于等于 1e-10的蛋白條數(shù)為21 895條, 注釋率為 82.22%; 進(jìn)一步限定被比對nr數(shù)據(jù)庫蛋白長度覆蓋度≥90%, 得到高質(zhì)量注釋蛋白11 457條, 占43.02%。

預(yù)測蛋白BLAST比對KEGG數(shù)據(jù)庫, 進(jìn)行代謝途徑分析, 比對參數(shù)E≤1e-10。結(jié)果發(fā)現(xiàn), 26 629條蛋白中, 有 21 469條得到了 KEGG注釋, 注釋率80.62%, 含蛋白數(shù)目最多的前10大類 (圖1)分別是：嘌呤代謝(Purine metabolism), ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)因子(ABC transporters), 嘧啶代謝(Pyrimidine metabolism), 丙酮酸代謝(Pyruvate metabolism), 纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解(Valine, leucine and isoleucine degradation), 核糖體(Ribosome), 甘氨酸絲氨酸和蘇氨酸代謝(Glycine, serine and threonine metabolism),雙組分信號傳導(dǎo)系統(tǒng)(Two-component system), 丙酸代謝(Propanoate metabolism), 丁酸代謝(Butanoate metabolism)。

圖1 塊結(jié)合條斑紫菜預(yù)測蛋白KEGG注釋分析Fig. 1 KEGG analysis for predicted proteins of P. yezoensis

3 討論

國際生物基因資源研究的特點(diǎn), 一方面是從模式生物基因組學(xué)入手, 研究生物個體發(fā)育和系統(tǒng)發(fā)育的規(guī)律以及生物對環(huán)境的響應(yīng)機(jī)制; 另一方面是從實(shí)際應(yīng)用入手, 進(jìn)行基因組序列測定, 并分離、克隆和表達(dá)有用的功能基因。自1990年人類基因組計(jì)劃實(shí)施以來, 已經(jīng)完成了人類、家豬、水稻、家蠶、擬南芥、酵母等50余種生物的全基因組測序工作。而在水生生物研究領(lǐng)域, 類似研究進(jìn)展相對滯后。目前, 只在大型藻類的線粒體及葉綠體細(xì)胞器基因組結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)進(jìn)化方面有所推進(jìn)[24]。Shivji[25]在上世紀(jì)90年代初構(gòu)建了條斑紫菜葉綠體基因組圖譜并對其結(jié)構(gòu)作了報(bào)道, Reith[26]構(gòu)建了P. Purpurea的葉綠體基因組圖譜, 發(fā)現(xiàn)有 46%的基因?yàn)殛懮参锼痪邆洹?/p>

地球環(huán)境演變是生物類群的起源與發(fā)展的重要因素之一, 生物對環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化以及環(huán)境變化對生物的選擇, 是生物多樣性發(fā)生的主要原因。大型紅藻作為海洋初級生命系統(tǒng)中進(jìn)化較為低等的水生植物, 其在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理和生存環(huán)境方面都與陸地植物有著很大的不同, 僅光合作用色素體一項(xiàng)其多樣性就遠(yuǎn)高于陸地植物。因此, 國際上普遍認(rèn)為,大型紅藻生物學(xué)方面的研究, 在生物進(jìn)化與系統(tǒng)演化方面具有重要的科學(xué)價(jià)值。例如,P. Purpurea的葉綠體基因組上大量的編碼序列和相對很少的內(nèi)含子以及操縱子序列的保守性都表明了紫菜質(zhì)體基因組特有的原始特征。除了基因組中的編碼區(qū), 重復(fù)序列也逐漸引起人們的關(guān)注, 其重要特征是在進(jìn)化中具有很快的演化速度, Mizukami[27]認(rèn)為這些高度重復(fù)序列可以作為紅藻門種系發(fā)生的一種研究工具。

條斑紫菜生活于潮間帶, 周期性地經(jīng)歷著潮漲潮落的特殊生存條件, 特殊的生存環(huán)境孕育了獨(dú)特的代謝途徑, 使之擁有了多種陸生生物所不具備的特殊基因。因此有必要對紫菜的遺傳背景進(jìn)行更廣泛和深入的系統(tǒng)研究, 從而更好地利用紫菜豐富的基因資源, 為我國工業(yè)、農(nóng)業(yè)、藥物產(chǎn)業(yè)服務(wù)。條斑紫菜作為我國水產(chǎn)業(yè)重要的經(jīng)濟(jì)栽培物種, 在食用及環(huán)境修復(fù)方面, 具有顯著而重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、環(huán)境價(jià)值和研究意義, 開展條斑紫菜基因組及功能基因的研究, 還將有助于培育出優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆的養(yǎng)殖新品種, 從根本上解決海水養(yǎng)殖生物“質(zhì)”、“量”和“病”的問題。因此, 有必要開展其基因組與功能基因研究工作, 以支撐我國生態(tài)養(yǎng)殖及海洋生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。目前NCBI公共數(shù)據(jù)庫中只有931個條斑紫菜蛋白, 而本研究所得條斑紫菜基因組草圖預(yù)測得到26 629個蛋白編碼基因(11 457個高可信度預(yù)測基因), 證明紫菜基因組相對復(fù)雜, 所以有必要進(jìn)行條斑紫菜基因組精細(xì)圖譜的繪制, 使快速鑒定大部分條斑紫菜功能基因成為可能。

基因組研究模式物種選擇的標(biāo)準(zhǔn)在于： 研究對象所具有的性狀具有一定的代表性; 生物體便于培養(yǎng), 利于研究工作的進(jìn)行; 具有相關(guān)豐富的研究背景(包括生態(tài)、生理、生化以及分子生物學(xué)的一系列相關(guān)研究結(jié)果和經(jīng)驗(yàn)); 能夠充分利用現(xiàn)有方法和手段進(jìn)行深入研究以及基因組的結(jié)構(gòu)和大小[28]。由于紫菜的基因組相對較小, 大約為 2.6×108bp堿基對,代時較短, 約1～3個月就可完成一個世代, 因而, 適于基因組分析。其孢子體形式便于建立各種純系及實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng), 目前關(guān)于紫菜生活史、生理生化及遺傳學(xué)方面的研究以條斑紫菜居多, 并且研究也較為深入, 因而條斑紫菜一直被認(rèn)為是紅藻等大型藻類基因組研究較為理想的模式生物[7]。

綜上所述, 開展條斑紫菜的基因組測序及繪制其精細(xì)圖譜, 不僅具有重要的理論意義, 而且對于開展紫菜的遺傳育種, 促進(jìn)我國條斑紫菜產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有指導(dǎo)意義。

[1]Yoshida T, Notoya M, Kikuchi N,et al. Catalogue of species of Porphyra in the world, with special reference to the type locality and bibliography[J]. Natural History Research (Special Issue), 1997, 3： 5-18.

[2]曾呈奎, 張德瑞．紫菜的研究 I．甘紫菜的生活史[J]．植物學(xué)報(bào), 1954, 3(3)： 287-302．

[3]張學(xué)成, 許璞, 秦松, 等．海藻遺傳學(xué)[M]．北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2005．

[4]Chopin T, Yarish C, Wilkes R, et al．DevelopingPorphyra/salmonintegrated aquaculture or bioremediation and diversification of the aquaculture industry[J]．Journal of Applied Phycology, 1999, 11： 463-472．

[5]Radmer R J．Algal diversity and commercial algal products [J]. Bioscience, 1996, 46(4)： 263-270．

[6]馬家海, 蔡守清. 條斑紫菜的栽培與加工[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社, 1996.

[7]Sahoo D, Tang X R, Yarish C.Porphyra-the economic seaweed as a new experimental system [J].Current Science, 2002, 83： 1313-1316．

[8]Stiller J, waaland J R.Molecular analysis reveals critical diversity inPorphyra(Rhodophyta) [J]．Journal of Phyco1ogy, 1993, 29： 506-517．

[9]Lee E K, Seo S B, Kim T H, et al．Analysis of expressed sequence tags ofPorphyra yezoensis[J]．Molecules and Cells, 2000, 10： 338-342．

[10]馬凌波, 張鳳英．條斑紫菜細(xì)胞質(zhì)甘油醛-3-磷酸脫氫酶的 cDNA克隆和序列分析[J], 海洋漁業(yè),2004,26(4)： 300-305．

[11]Asamizu E, Nakajima M, Kitade Y, et al．Comparison of expression profiles between the two generations ofPorphyra yezoensis(Rhodophyta), based on expressed sequence tag frequency analysis [J]．Journal of Phycology, 2003, 39： 923-930．

[12]Nikaido I, Asamizu E, Nakajima M, et al．Generation of 10154 expressed sequence tags from a leafy gametophyte of a marine red Alga,Porphyra yezoensis[J]．DNA Research, 2000, 7： 223-227．

[13]楊官品, 沈懷舜, 許璞, 等．條斑紫菜絲狀孢子體表達(dá)序列標(biāo)簽分析[J]．高技術(shù)通訊, 2002, 12： 93-97．

[14]楊官品, 劉永建, 孫雪, 等．條斑紫菜絲狀孢子體cDNA文庫構(gòu)建及抗病相關(guān)基因鑒定[J]．青島海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 33： 47-52．

[15]Xu M J, Mao Y X, Zhang X C, et al．Bioinformatic analysis of expresed sequence tags from sporophyte ofPorphyra yezoensis[J]．Progress In Natural Science,2005, 12： 24-34．

[16]龐國興, 王廣策, 胡松年, 等．壇紫菜絲狀孢子體EST的獲取及其生物信息學(xué)分析[J]．海洋與湖沼,2005, 36： 452-458．

[17]Kitade Y, Fukuda S, Nakajima M, et al．Isolation of a cDNA encoding a homologue of actin fromPorphyra yezoensis(Rhodophyta) [J]．Journal of Applied Phycology, 2002, 14： 135-141．

[18]David R B, Shankar B, Harold P S, ea al. Accurate whole human genome sequencing using reversible terminator chemistry [J]．Nature, 2008, 456： 53-59．

[19]Li R Q, Zhu H M, Ruan J, et al. De novo assembly of human genomes with massively parallel short read sequencing [J]. Genome Research, 2010, 20： 265-272.

[20]Kent W J. BLAT-The BLAST-Like Alignment Tool[J]．Genome Research, 2002. 12(4)： 656-664.

[21]Stanke M, Diekhans M, Baertsch R, et al. Using native and syntenically mapped cDNA alignments to improve de novo gene finding [J]．Bioinformatics, 2008, 24：637-644.

[22]Guy St C S, Ewan B. Automated generation of heuristics for biological sequence comparison [J]．BMC Bioinformatics, 2005, 6： 31.

[23]Minoru K, Susumu G, Miho F, et al. KEGG for representation and analysis of molecular networks involving diseases and drugs [J]．Nucleic Acids Research, 2010, 38： 355-360.

[24]Crepineau F, Roscoe T, Kaas R, et al. Characterisation of complementary DNAs from the expressed sequence tag analysis of life cycle stages ofLaminaria digitata(Phaeophyceae)．Plant Molecular Biology, 2000, 43：503-513．

[25]Shivji M S．Organization of the chloroplast genome in the red algaPorphyra yezoensis[J]．Current Genetics,1991, 19： 49-54．

[26]Reith M, Munholland J．A high resolution gene ma p of the chloroplast genome of the red algaPorphyra purpurea[J]．Plant Cell, 1993, 5： 465-475．

[27]Mizukami Y, Kito H, Kunimoto M, et al．Cloning and characterization of G +C rich, highly repeated DNA sequences fromPorphyra yezoensis(1aver) Rhodophyta[J]．Journal of Applied Phycology, 2000, 12： 131-138．

[28]Grossman A R．Paths toward algal genomics [J]．Plant Physiology, 2005, 137： 410-427．

The analysis of the low coveragePorphyra yezoensisdraft genome

NIU Jian-feng1, GAO Sheng-han2, LUO Ying-feng2, YUAN Ye2, WANG Guang-ce1,HU Song-nian2
(1. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Institute of Genomics,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100029, China)

Nov., 10, 2010

Porphyra yezoensis; Solexa high-throughput sequencing system; metabolic pathway

We constructed the low-coveragePorphyra yezoensisdraft genome using the Solexa high-throughput sequencing system. The predicted genome size was approximately 220 Mbp, with the GC content of 53.09%. The draft genome contained 26 629 predicted protein-coding genes, 16 409 of which had introns, averagely 2.22 introns per gene. Gene structure analysis of intron-containing genes showed that the average gene size and intron size was 2214 bp and 319 bp, respectively. Metabolic pathway analysis indicated that the purine metabolism was the largest pathway. TheP.yezoensisdraft genome constructed in this study manifested important genomic properties such as genome size and the gene structure of protein-coding gene, proving the feasibility of Solexa high-throughput system in sequencing the whole genome ofP.yezoensis.

Q949.21; Q942.4

A

1000-3096(2011)06-0076-06

2010-11-10;

2011-02-25

國家 863計(jì)劃項(xiàng)目(2007AA09Z406); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30830015); 國家973計(jì)劃前期專項(xiàng)(2011CB411908)

牛建峰(1977-), 男, 山西榆次人, 副研究員, 主要從事藻類生理生化研究, 電話： 0532-82898575, E-mail： jf_niu@sina.com.cn;王廣策, 通信作者, E-mail： gcwang@ms.qdio.ac.cn; 胡松年, 通信作者, E-mail： husn@big.ac.cn

梁德海)