FUT2基因單核苷酸位點多態(tài)性與母乳中性寡糖水平關聯(lián)性研究

張卓君 張 磊 姚 文 王艷艷 Ardythe Morrow 彭詠梅

母乳喂養(yǎng)是可減少兒童患病率和死亡率的一種健康促進行為。而許多健康促進的效應都可歸因于母乳中發(fā)現(xiàn)的各種生物活性因子。一些局限于特定人群的研究已經表明母乳中生物活性因子的差別可以影響兒童的健康和發(fā)育[1～4]。

寡糖是母乳中僅次于乳糖和脂肪的第三大固體組分，是近年來母乳生物活性因子研究的熱點之一。中性寡糖是保護嬰兒胃腸道的天然屏障，能降低早期嬰兒腹瀉和腸道感染[3,5～8]，可能降低泌尿道和呼吸道的感染[9，10]。近來有研究報道，母乳寡糖特別是2位連接的巖藻糖基寡糖有可能減少HIV感染的風險[11，12]。

母乳中性寡糖主要為巖藻糖基寡糖，巖藻糖基通過酶的作用連接到乳?；虬肴樘巧蠘嫵善浠窘Y構，其連接可以有α1,2、α1,3和α1,4等形式。不同種族的母親母乳中性寡糖的種類和水平差異很大，認為編碼酶的基因可能存在人群多態(tài)性并影響母乳中性寡糖的表達。在前期研究中發(fā)現(xiàn)FUT2的SNP位點rs601338的基因型是美國母親控制母乳ɑ1,2巖藻糖基寡糖水平的關鍵位點，但該位點的基因型并不影響中國母親母乳α1,2巖藻糖寡糖的表達。本次選取了FUT2的另一個SNP位點rs1047781進行研究，以進一步探究中國母親母乳中性寡糖水平與FUT2的SNP位點基因型之間的關系。

1 方法

1.1 納入標準 ①健康足月兒的母親；②母親年齡18～49歲；③計劃在產后3個月內至少75%以母乳喂養(yǎng)嬰兒。

1.2 排除標準 ①雙胞胎或多胞胎的母親；②早產兒(胎齡<37周或出生體重<2 500 g)。

1.3 樣本收集 產后2周收集母乳和母親唾液樣本。收集母乳時吸空一側乳房所有乳汁，充分混勻后，分裝至2 mL凍存管，-80℃保存。用Oragene試劑盒收集母親唾液，4℃保存。

1.4 中性寡糖水平測定 共測定9種中性寡糖的水平，9種寡糖的相對分子質量和連接形式如表1所示。

1.4.1 儀器與設備 制備液相色譜分析儀LC-8A (日本Shimadzu公司)，示差檢測器RID-10A(日本Shimadzu公司)，紫外檢測器SPD-20A(日本Shimadzu公司)，液相色譜分析儀LC-20AD(日本Shimadzu公司)，ODS-100Z色譜分析柱(4.6 mm×250 mm)(日本Tosoh公司)，冷凍干燥儀1-2LD (德國Christ公司)，真空濃縮儀RVC 2-2S(德國Christ公司)，Bio Gel P-2(Extra fine,<45 μm)(美國Bio Rad公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

表1 9種中性寡糖的相對分子質量和連接形式

Tab 1 Molecular weight and connective type of 9 neutral oligosaccharides

OligosaccharideAbbreviationMolecualarWeightLocationoffucose2'-Fucosyllactose2'-FL488.44ɑ1,23-Fucosyllactose3-FL488.44ɑ1,3Lacto-N-fucopentaose-ⅠLNFP-Ⅰ853.70ɑ1,2Lacto-N-fucopentaose-ⅡLNFP-Ⅱ853.70ɑ1,4Lacto-N-fucopentaose-ⅢLNFP-Ⅲ853.70ɑ1,3Lacto-N-difucohexaose-ⅠLNDFH-Ⅰ999.91ɑ1,2Lacto-N-difucohexaose-ⅡLNDFH-Ⅱ999.91ɑ1,4Lacto-N-tetraoseLNT707.64NofucoseLacto-N-neotetraoseLNnT707.64Nofucose

1.4.2 試劑 PMP(美國Sigma公司)，乙腈(德國Fisher公司)，寡糖標準品(英國Dextra實驗室)。

1.4.3 實驗步驟 依據(jù)文獻[13,14] 建立的HPLC法測定母乳中性寡糖水平。方法如下：取母乳1 mL融化后用氯仿/甲醇萃取，用Bio Gel P-2(<45 μm)柱(2.6 cm×100 cm)層析，用示差檢測器記錄洗脫圖,峰值部分，分Pool1(3糖)和Pool2(4-6糖)混合并凍干(圖1)。再用PMP行柱前衍生[1,2]。衍生后最終樣品先凍干，再溶解為1 mL，實際上樣量為10 μL，檢測波長245 nm。色譜條件：Pool1：緩沖體系：KH2PO40.1 mol·L-1，用KOH調pH至7.0，流速1 mL·min-1；A相含16%乙腈，B相含30%乙腈；洗脫梯度：0～30 min B相0～50%。Pool2：緩沖體系：NH4AC 0.1 mol·L-1，用CH3COOH調pH至4.5，流速0.8 mL·min-1；A相含10%乙腈，B相含25%乙腈；洗脫梯度：0～40 min B相40%～100%。寡糖標準品按同樣步驟衍生，并根據(jù)濃度(1 、2、5、10和20 μg)與峰面積繪制標準曲線，標準曲線的r2>0.99，計算實際樣品中的寡糖水平(圖2)。

1.5 Lewis表型的確定 Lewis表型與α1,2、α1,3和α1,4巖藻糖基轉移酶的表達關系見表2。

表2 Lewis表型與巖藻糖轉移酶表達關系

Tab 2 Relationship between Lewis phenotypes and the expression of fucosyltransferase

LewistypeLe(a-,b-)Le(a-,b+)Le(a+,b-)ɑ1,2linkedfucosyltransferase++-ɑ1,3linkedfucosyltransferase-++ɑ1,4linkedfucosyltransferase-++

母乳的Lewis表型可以分為3類[15]。Le(a-,b-)型：，因缺少ɑ1,3和ɑ1,4巖藻糖基轉移酶，母乳中3-FL，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅱ的水平較低；因存在ɑ1,2巖藻糖轉移酶2′-FL,LNFP-Ⅰ和LNDFH-Ⅰ水平較高。Le(a-,b+)：母乳可檢測出所有的巖藻糖基寡糖；Le(a+,b-)：因不表達ɑ1,2巖藻糖基轉移酶，而表達ɑ1,4和ɑ1,3巖藻糖基轉移酶，母乳中2′-FL,LNFP-Ⅰ和LNDFH-Ⅰ的水平較低，3′-FL，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅱ的水平較高。亞洲人群中存在Le(a+,b+)型，其FUT2酶部分失活[16]，但依據(jù)母乳中性寡糖的水平中難以判斷，這可能導致在分型時將該型也歸為Le(a+,b-)。

圖1 凝膠層析提純中性寡糖

圖2 中性寡糖色譜分析示意圖

Fig 2 HPLC analysis of neutral oligosaccharide

Notes A: standard; Pool1:B：little 3-FL in Le(a-,b-);C：3-FL and 2′-FL in Le(a-,b+);D：little 2′-FL in Le(a+,b-). Pool2:B：little LNDFH-Ⅱ、LNFP-Ⅱ+Ⅲ in Le(a-,b- );C：LNDFH-Ⅱ,LNDFH-Ⅰ,LNFP-Ⅰ and LNFP-Ⅱ+Ⅲ in Le(a-,b+);D：little LNDFH-Ⅰ and LNFP-Ⅰ in Le(a+,b-)

1.6 FUT2的SNP位點rs1047781多態(tài)性檢測

1.6.1 儀器與設備 NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(美國NanoDrop Technologies公司)；PCR儀2700(美國Applied Biosystem公司)；3130測序儀(美國Applied Biosystem公司)。

1.6.2 試劑 DNA Self-collection Kit(加拿大DNA Genotek公司)；Hidi(美國Applied Biosystem公司)；Bigdye(美國Applied Biosystem公司)；5×seqbuffer(美國Applied Biosystem公司)；10×buffer(瑞士Roche公司)；EXONI(美國Promega公司)；SAP(美國Promega公司)。

1.6.3 實驗步驟 母親唾液按標準流程提取DNA。擴增FUT2基因引物序列：正向: 5′-GCCCCCATC-TTCAGAATCAC-3′； 反向:5′-AGCAAACACCACATCACCGT-3′。測序反應體系96℃預變性10 s，進入熱循環(huán)，變性96℃10 s，退火50℃ 5 s，延伸64℃ 4 min，共循環(huán)25次，64℃終延伸4 min。經洗滌烘干，離心后用ABI 3130測序儀測序，獲取測序結果。

1.7 統(tǒng)計學方法 用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。多樣本均數(shù)之間的比較采用多個獨立樣本的Kruskal-Wallis檢驗，兩樣本均數(shù)的比較采用兩個獨立樣本的Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 2008年3～12月在上海國際和平婦嬰保健院產科住院的健康母親110名進入研究。年齡22～44歲，平均(29.4±3.8)歲；身高143～179 cm，平均(167±6)cm。

78/110名進行母乳中性寡糖水平檢測，其中30例在復旦大學生物醫(yī)學研究院采用本研究建立的方法測定，余48例由美國麻省總醫(yī)院實驗室采用其實驗室的方法進行分析；考慮實驗方法及儀器可能存在差異，且本研究的方法缺乏內參行回收率校正，故在按基因分型分組比較時，將數(shù)據(jù)轉化為各中性寡糖水平占所測總中性寡糖水平的比值再行分析。

2.2 Lewis表型的分布 根據(jù)母乳中性寡糖檢測結果確定Lewis表型，Le(a-,b-)占21.8%(21/78名)，Le(a-,b+)占51.3%(17/78名)，Le(a+,b-)占26.9%(40/78名)。

2.3 FUT2 的SNP位點rs1047781多態(tài)性檢測 FUT2是編碼α1,2連接鍵的巖藻糖基轉移酶的基因，該基因上的SNP位點rs1047781存在A/T兩種變異，在人群中存在AA，AT和TT 3種基因型(圖3)。105/110名母親的唾液樣本成功提取DNA完成測序，48.6%(51名)為雜合AT基因型，26.7%(28名)為純合AA基因型，24.8%(26名)為TT基因型。任意選取其中的50例樣本進行重復檢測，誤差率為0。

圖3 SNP位點rs1047781測序圖

Fig 3 Sequence containing SNP on gene FUT2

Notes A:AA;B:AT;C:TT

2.4 母親SNP位點rs1047781多態(tài)性與中性寡糖水平關系 同時完成母乳中性寡糖檢測及SNP多態(tài)性分析的樣本共60例。行Hardy-Weinberg平衡檢測(P=0.78)，提示符合Hardy-Weinberg平衡。按不同基因型分組分析，AA型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖含量豐富；TT型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖含量很少(P<0.01)；AT型母親α1,2連接的巖藻糖寡糖濃度介于兩者之間(圖4)。

圖4 不同基因型母乳α1,2連接巖藻糖基寡糖水平/總中性寡糖水平

Fig 4 ɑ1,2-linked oligosaccharides/total oligosaccharides of human milk

3 討論

3.1 母乳中性寡糖的Lewis表型 母乳寡糖健康促進作用的基礎很大程度上依賴于特殊的寡糖基序。結構變化可以產生無數(shù)母乳寡糖的不同結構，人類母乳至少含有數(shù)千種寡糖。Ninonuevo等[17]指出，在人類母乳總樣本中已鑒定出大約200種母乳寡糖分子，其中主要是含有巖藻糖基的中性寡糖，巖藻糖基的連接可以有ɑ1,2、ɑ1,3和ɑ1,4等方式，完成不同連接方式相應的酶為ɑ1,2、ɑ1,3和ɑ1,4連接酶。研究認為ɑ1,2連接酶是由FUT2基因編碼合成，而ɑ1,3和ɑ1,4連接酶可以由FUT3基因編碼合成[18]。

本研究和其他的相關研究都發(fā)現(xiàn)，不同泌乳期母親母乳中性寡糖水平存在很大的個體差異和人群差異[15，19]，而且即使是同一人在不同泌乳期也有很大的不同[20，21]。Erney等[22]分析了不同地理分布泌乳期人群的乳汁樣本，發(fā)現(xiàn)中性寡糖的水平存在地域性差異。在本研究前期發(fā)現(xiàn)，與課題合作方提供的美國母親的數(shù)據(jù)相比，中國母親母乳中性寡糖的水平明顯偏低。

根據(jù)母乳中性寡糖種類和水平分類，本研究中檢測的母乳樣本中Lewis表型Le(a-,b-)、Le(a-,b+)和Le(a+,b-)分布與中國浙江省人群[23]的分布相似，而根據(jù)母乳中性寡糖分布特點會將Le(a+,b+)也歸為Le(a+,b-)，故導致本研究中Le(a+,b-)母親的比例偏高。

因Le(a-,b-)，Le(a-,b+)型約占總人群的80%，而該兩型的母親體內均有α1,2巖藻糖基轉移酶的表達，故整體而言，母乳中ɑ1,2連接的巖藻糖基寡糖的水平明顯高于α1,3和α1,4巖藻糖基寡糖。有國外相關文獻報道證實α1,2連接的巖藻糖基寡糖具有更重要的生物學意義[24，25]，其在哺乳期早期的高表達可能也與其重要的生物學功能相關。在前期研究中發(fā)現(xiàn)中國母親母乳中各中性寡糖在產后2、4 和13 周變化差異很大[21]，其中2′-FL與3′-FL 持續(xù)上升，而LNFP-Ⅰ則持續(xù)下降，LNFP-Ⅱ，LNFP-Ⅲ，LNDFH-Ⅰ無明顯變化。母乳中性寡糖隨時間變化產生的差異，也提示了某些特定種類的中性寡糖對嬰兒健康可能具有更重要的促進作用。

3.2 FUT2的SNP位點rs1047781多態(tài)性對母乳巖藻糖寡糖水平的影響 本研究選取了FUT2的另一個SNP位點rs1047781進行研究。觀察到FUT2的SNP位點rs1047781 A/T多態(tài)性可影響母乳中α1,2連接巖藻糖基寡糖的表達。AA基因型母親因為不能編碼α1,3和α1,4巖藻糖基轉移酶，因此母乳中α1,3或α1,4連接巖藻糖基寡糖水平非常低；另外，母乳中可能由于缺乏與α1,2巖藻糖基轉移酶競爭底物的酶，使α1,2連接巖藻糖基寡糖水平較高。相反，TT基因型母親母乳中α1,3和α1,4連接巖藻糖基寡糖水平豐富，而α1,2連接巖藻糖基寡糖水平較低。AT基因型母親α1,3和α1,4連接巖藻糖基寡糖的水平，α1,2連接巖藻糖基寡糖的水平都介于AA型和TT基因型母親之間。本研究結果可以推測，F(xiàn)UT2基因SNP位點rs1047781具A/T多態(tài)性，是控制中國母親表達α1,2連接巖藻糖基轉移酶的關鍵位點。

本研究的不足之處和局限性：本課題在實驗方法學上進行了嘗試，但檢測效率較低，單樣本耗時太長，完整分析一個樣本約需24 h，且無內參進行回收率校正，僅為半定量檢測。同時，母乳樣本收集的時間，母乳的保存時間，母親的身體狀態(tài)，都有可能對母乳中性寡糖水平產生影響。故在實驗方法學上尚需進一步完善。目前針對中國母親母乳中性寡糖的研究報道罕見，進一步的研究有賴于更大樣本及較長時間的縱向隨訪。

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