薛利軍 蘇全勝 劉小北 冒曉蓓 任麗麗 許 晶 褚曉源

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，南京210002)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是胃癌的獨(dú)立致病因子，已被國際癌癥研究署(IARC)明確列為Ⅰ類致癌因子，其在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中均發(fā)揮重要作用［1］。已知50% ～90%的胃癌患者有Hp感染史，新近臨床研究顯示該類患者可能具有更好的預(yù)后［2-4］。探討Hp相關(guān)免疫應(yīng)答在胃癌患者體內(nèi)的潛在抗腫瘤效應(yīng)，將有助于揭示Hp感染與胃癌預(yù)后之間關(guān)聯(lián)的免疫學(xué)機(jī)制。

空泡毒素 A(Vacuolating toxin A，VacA)、細(xì)胞毒素A(Cytotoxin-associated gene A，CagA)及血型抗原結(jié)合性粘附素(Blood-group antigen-binding adhesion，BabA)是Hp感染后產(chǎn)生的幾個(gè)關(guān)鍵性毒力因子，其與宿主細(xì)胞的相互作用對癌變發(fā)生起到重要作用［5］。VacA、CagA和BabA不僅能模擬并結(jié)合到胃上皮細(xì)胞與血小板的表面分子或受體，尚可在宿主體內(nèi)誘發(fā)較高水平的特異性抗體［6］。VacA、CagA及BabA作為Hp相關(guān)免疫應(yīng)答重要的保護(hù)性抗原，已成為目前Hp疫苗研究的候選熱點(diǎn)［7］。

本研究擬通過生物信息學(xué)軟件，對Hp VacA、CagA和BabA蛋白的二級結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位進(jìn)行預(yù)測，綜合分析后初步確定其潛在的高效免疫表位，為構(gòu)建相應(yīng)的DNA或亞單位疫苗并進(jìn)一步用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1氨基酸序列分析與菌株選擇 目前，已公布基因組序列的Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株主要有 G27、J99、P12和26695等。查找GenBank數(shù)據(jù)庫，分別下載各菌株相應(yīng)的VacA、CagA和BabA氨基酸序列，其登錄號分別為 208434795、208434469 和 208434264(G27)，15611886、15611562 和 15611900(J99)，210135077、210134750 和210135084(P12)，15645505、15645173 和15645857(26695)。通過 DNASTAR軟件包的MegAlign軟件，分別對四種菌株的三個(gè)氨基酸序列進(jìn)行比對。根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果，選取合適的某一種標(biāo)準(zhǔn)菌株作為Hp蛋白質(zhì)免疫表位分析的源菌株。

1.2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 一般而言，符合優(yōu)勢免疫表位的氨基酸區(qū)段具有親水性強(qiáng)、易暴露于蛋白質(zhì)表面、含有或鄰近柔性區(qū)域、易于折疊或卷曲形成二級結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)［8］。了解蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)情況，對綜合分析其免疫表位分布有重要意義。通過DNASTAR軟件包的Protean軟件，應(yīng)用Chou-Fasman和Garnier-Robson方法，分別預(yù)測蛋白質(zhì)的α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角以及卷曲等二級結(jié)構(gòu)。

1.3B細(xì)胞表位預(yù)測 通過DNASTAR軟件包的Protean 軟件，應(yīng)用 Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle和Karplus-Schulz方法，分別預(yù)測VacA、CagA和BabA蛋白質(zhì)的抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性和柔性區(qū)域。進(jìn)一步綜合分析后，得出VacA、CagA和BabA的優(yōu)勢B細(xì)胞免疫表位。

2 結(jié)果

2.1氨基酸序列分析與菌株選擇 通過MegAlign軟件(Jotun Hein算法)，分別對 Hp G27、J99、P12 和26695菌株相應(yīng)的VacA、CagA和BabA氨基酸序列進(jìn)行分析。進(jìn)化樹分析結(jié)果提示，Hp J99菌株的VacA、CagA和BabA在總體上更接近共同序列(圖1)。比對顯示，Hp J99菌株上述三種蛋白質(zhì)的氨基酸序列分別與G27、P12和26695菌株相應(yīng)序列的同源性為 95.2%、90.8%和 91.2%(VacA)，88.4%、88.8%和 88.0%(CagA)，92.2%、92.2% 和93.6%(BabA)。因此，Hp J99被選作源菌株，進(jìn)一步用于VacA、CagA和BabA的免疫表位預(yù)測分析。

2.2二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2.1VacA蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 分別應(yīng)用Chou-Fasman和Garnier-Robson兩種方法分析VacA蛋白的氨基酸序列。綜合結(jié)果顯示，VacA的α螺旋主要分布于 1～7、19～23、65 ～73、131～140、157～163、298 ～301、500 ～ 506、620 ～622、693 ～698、720 ～ 732、753 ～ 762、861 ～ 863、882 ～ 888、936 ～954、989 ～1 012、1 093 ～1 106、1 147 ～1 153、1 212～1 220和1 252～1 264;β折疊主要分布于12 ～18、37 ～60、81 ～85、219 ～223、262 ～267、274 ～276、281 ～ 285、310 ～ 316、322 ～ 325、360 ～ 363、390～395、492 ～498、534 ～ 545、560 ～567、576 ～583、664 ～ 670、676 ～ 679、684 ～ 688、769 ～ 775、799～812、820 ～825、894 ～899、909 ～915、1 056 ～1 059、1 087～1 090及1 175～1 179;在各α螺旋及β折疊單元之間尚有長短不一的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(圖2)。結(jié)果還提示，對Chou-Fasman和Garnier-Robson兩種方法而言，前者預(yù)測的VacA蛋白轉(zhuǎn)角數(shù)量顯著多于后者，后者預(yù)測的β折疊數(shù)量明顯高于前者，但其預(yù)測的α螺旋數(shù)量則較為接近。

圖1 幽門螺桿菌G27、J99、P12和26695菌株的VacA、CagA和BabA序列進(jìn)化樹分析Fig．1 Phylogenic tree analysis of VacA，CagA and BabA amino acids sequences among multiple H.pylori strains including G27，J99，P12 and 26695

2.2.2CagA蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 綜合采用Chou-Fasman和 Garnier-Robson方法分析，結(jié)果顯示，CagA的α螺旋主要分布于1～6、56～74、155～168、184 ～ 196、229 ～ 232、259 ～ 262、275 ～ 279、284～287、315 ～320、380 ～384、393 ～407、412 ～432、437 ～ 444、456 ～ 464、480 ～ 492、531 ～ 535、556～567、574 ～582、587 ～ 593、598 ～603、608 ～637、646 ～ 650、655 ～ 667、672 ～ 686、691 ～ 694、717～725、741 ～752、794 ～800、807 ～815、820 ～827、859 ～ 865、871 ～ 880、905 ～915、926 ～ 945、965 ～989、995 ～1 002、1 007 ～1 013、1 027 ～1 033、1 061～1 072、1 124～1 127和1 144～1 154;β折疊主要分布于552～555;在α螺旋及β折疊之間有一些轉(zhuǎn)角和卷曲結(jié)構(gòu)(圖3)。在CagA，用 Chou-Fasman方法所預(yù)測的α螺旋數(shù)量稍多于用Garnier-Robson方法，而前者預(yù)測的β折疊和轉(zhuǎn)角數(shù)量均顯著高于后者。

2.2.3BabA蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 綜合上述兩種方法分析，結(jié)果顯示，BabA的α螺旋主要集中于35～41、82 ～91、170 ～184、192 ～196、279 ～286、324～342、370 ～394、467 ～481、670 ～673、676 ～683、688～692、702 ～709、725 ～731;β 折疊主要分布于5～19、26 ～34、65 ～71、105 ～108、112 ～123、150～155、201 ～208、218 ～222、232 ～238、243 ～252、262 ～271、287 ～293、347 ～350、407 ～419、437～442、447 ～455、496 ～501、538 ～546、554 ～559、570～581、612 ～615、623 ～626、639 ～651、710 ～716、721～724、732～744;在各 α 螺旋及 β 折疊之間散布有長短不一的轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)(圖4)。對于 BabA，分別用 Chou-Fasman和 Garnier-Robson方法預(yù)測的α螺旋數(shù)量相仿，但前者預(yù)測的β折疊和轉(zhuǎn)角數(shù)量則分別少于和顯著高于后者。

2.3B細(xì)胞表位預(yù)測

2.3.1VacA B細(xì)胞表位預(yù)測 采用Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle 和Karplus-Schulz方法，分別預(yù)測VacA的抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性和柔性區(qū)域(圖2)，綜合結(jié)果顯示，5 ～11、28 ～31、66 ～80、92～101、176 ～186、328 ～358、364 ～375、614～638、751～759、794 ～800、829 ～851、888 ～894、928 ～938、951～957、976～983、1 013～1 020、1 168～1 175 及1 235～1 243為優(yōu)勢表位候選區(qū)段。

圖2 VacA蛋白的二級結(jié)構(gòu)與抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性及柔性區(qū)域分析Fig．2 Analysis of antigenic indexes，surface probability plots，hydrophilicity plots and flexible regions in VacA protein

圖3 CagA蛋白的二級結(jié)構(gòu)與抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性及柔性區(qū)域分析Fig．3 Analysis of antigenic indexes，surface probability plots，hydrophilicity plots and flexible regions in CagA protein

圖4 BabA蛋白的二級結(jié)構(gòu)與抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性及柔性區(qū)域分析Fig．4 Analysis of antigenic indexes，surface probability plots，hydrophilicity plots and flexible regions in BabA protein

2.3.2CagA B細(xì)胞表位預(yù)測 應(yīng)用Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle 和 Karplus-Schulz方法，分別預(yù)測VacA的抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性和柔性區(qū)域(圖3)。結(jié)果顯示，優(yōu)勢表位主要分布在5 ～12、40 ～57、60 ～82、126 ～137、149 ～158、175 ～181、188 ～205、221 ～236、327 ～335、340 ～346、369 ～400、410 ～439、476 ～492、508 ～520、602 ～657、665 ～671、682 ～722、752 ～774、783 ～791、815 ～839、864 ～876、883 ～898、903 ～913、932 ～940、964 ～974、980 ～992、1 013 ～1 021、1 040 ～1 065、1 103 ～1 119及1 154～1 167等區(qū)段。

2.3.3BabA B細(xì)胞表位預(yù)測 采用Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle和 Karplus-Schulz方法，分別預(yù)測VacA的抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性和柔性區(qū)域(圖4)。綜合分析顯示，19～25、41～55、59 ～65、130 ～137、143 ～ 151、171 ～ 178、224 ～234、252 ～259、303 ～316、350 ～368、464 ～473、483 ～495、513～537、546～552、580～588及692～702為主要的優(yōu)勢表位區(qū)段。

3 討論

自1982年Warren和Marshall發(fā)現(xiàn)Hp以來，Hp疫苗研究主要是針對感染的預(yù)防和控制，以期實(shí)現(xiàn)對慢性胃炎、胃潰瘍、十二指腸潰瘍乃至胃癌等相關(guān)疾病的病因?qū)W預(yù)防。相關(guān)的疫苗種類包括滅活菌體疫苗、亞單位疫苗、活載體疫苗和DNA疫苗等。其中，以 VacA、CagA、BabA、尿素酶、熱休克蛋白(HSP)、中性粒細(xì)胞活化蛋白(NAP)或過氧化氫酶等為主要候選抗原的亞單位疫苗研究在近年占有較大比例［7，9］。由于大多數(shù)候選抗原為 Hp關(guān)鍵的致病因子，盡管免疫原性強(qiáng)，但往往有較大毒性，直接免疫接種容易引發(fā)明顯副反應(yīng)。DNA疫苗則可通過基因改造在最大程度上減少或避免毒性，同時(shí)保留或增強(qiáng)其免疫功效，因而是Hp疫苗研究的重要方向之一［9］。

VacA與CagA主要借助Hp的Ⅳ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入胃上皮細(xì)胞，可破壞細(xì)胞間連接并穿透細(xì)胞壁，繼而誘發(fā)包括中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)在內(nèi)的免疫反應(yīng)［10］。VacA活化肥大細(xì)胞并刺激產(chǎn)生TNF-α等細(xì)胞因子，因而可能作為一種Hp前炎癥因子在天然免疫應(yīng)答的早期發(fā)揮作用［11］。VacA尚通過結(jié)合CD18受體及促進(jìn)淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(LFA-1)的再循環(huán)，高效進(jìn)入活化的人T淋巴細(xì)胞并調(diào)節(jié)宿主的免疫應(yīng)答［12］。然而，VacA可在體外與人B細(xì)胞受體結(jié)合，抑制B細(xì)胞的增殖［13］。完整的VacA蛋白還能與人T細(xì)胞受體結(jié)合，抑制包括由其它Hp抗原誘發(fā)的T細(xì)胞克隆性增殖，從而導(dǎo)致免疫逃避和感染慢性化;當(dāng)其位于氨基端的疏水區(qū)發(fā)生某些突變后，則不再對T細(xì)胞活化產(chǎn)生抑制作用［13，14］。C57BL/6 小鼠實(shí)驗(yàn)表明，口服重組表達(dá)的可溶性VacA蛋白聯(lián)合CpG寡核苷酸佐劑進(jìn)行免疫，可激發(fā)特異性的抗體與粘膜免疫應(yīng)答，提示VacA抗原含有可作為候選疫苗組分的構(gòu)象性表位［15］。有研究者將預(yù)測的VacA表位與大腸桿菌不耐熱腸毒素LTB進(jìn)行融合，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性的血清IgG水平明顯升高，并且抗血清能在體外有效中和VacA的細(xì)胞毒性［16］。此外，將重組的VacA和CagA蛋白與去毒的大腸桿菌腸毒素LTK63一起經(jīng)鼻免疫小鼠后，不僅成功清除慢性Hp感染，還能有效預(yù)防再感染［17］。

CagA與VacA、NAP都是Hp疫苗安全、有效的候選抗原，CagA尚被確定為致潰瘍Hp菌株唯一的指示性免疫原［7，18，19］。CagA 不僅自身能誘導(dǎo)特異性T細(xì)胞應(yīng)答，還參與了Hp活菌對CD3+和γδ+T淋巴細(xì)胞的活化，繼而上調(diào)CD69及TNF-α和IFN-γ等細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)非特異性免疫應(yīng)答［20］。在體液免疫方面，CagA可誘發(fā)以IgG1和IgG3亞類為主的IgG水平升高，以及較高滴度的抗 Hp IgA抗體［21，22］。然而，在 DC 細(xì)胞內(nèi)發(fā)生酪氨酸磷酸化的CagA蛋白，對DC功能起負(fù)性調(diào)控，進(jìn)而抑制CD4+T細(xì)胞向Th1分化［23］。已證實(shí)，CagA含有MHCⅡ限制性T細(xì)胞表位，并且其中間段和羧基端存在數(shù)個(gè)非重疊表位［24］。Graessle等報(bào)道，CagA羧基端一個(gè)58 kD的重組片段等同于天然CagA蛋白的免疫效果，并被視為用于Hp血清學(xué)診斷的合適的抗原組分［18］。BabA也可安全地誘導(dǎo)特異性的體液和細(xì)胞保護(hù)性免疫應(yīng)答［7，25］。并且，BabA 通過介導(dǎo) Hp對宿主細(xì)胞表面Lewis b血型抗原分子的粘附，促進(jìn)細(xì)菌定植與粘膜局部IL-8的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)非特異性免疫應(yīng)答［26］。

選取具有合適二級結(jié)構(gòu)并富含高效免疫表位的區(qū)段，是疫苗設(shè)計(jì)中候選抗原的首要考慮。目前，已有成熟的生物信息學(xué)軟件，通過對蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)、抗原性指數(shù)、表面可能性、氨基酸親水性及柔性區(qū)域進(jìn)行分析，從而預(yù)測其B細(xì)胞表位。本研究采用 Protean 軟件中 Chou-Fasman、Garnier-Robso、Jameson-Wolf、Emini、Kyte-Doolittle 和 Karplus-Schulz 等方法，分別對Hp J99菌株VacA、CagA及BabA蛋白的全長氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果提示：①VacA和BabA有較多的β折疊，CagA主要由大量α螺旋組成，三者轉(zhuǎn)角或卷曲的構(gòu)成比例則基本相似。②VacA蛋白有5～11、28～31和1235～1243等18個(gè)優(yōu)勢B細(xì)胞表位區(qū)段，BabA的優(yōu)勢表位有19～25、41～55和692～702等16個(gè)區(qū)段;CagA有更多的B細(xì)胞表位，主要分布在5～12、40～57及1 154～1 167等30個(gè)區(qū)段。由于各蛋白分子量大、氨基酸序列較長，所預(yù)測的B細(xì)胞表位區(qū)段較多且較為分散。因此，真正高效的免疫表位尚需進(jìn)一步通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

1 International Agency for Research on Cancer.Infection with Helicobacter pylori.In：IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans.Schistosomes，liver flukes and Helicobacter pylori.［J］Lyon：IARC，1994;61：177-244.

2 Beswick E J，Pinchuk I V，Minch K.The Helicobacter pylori Urease B subunit binds to CD74 on gastric epithelial cells and induces NF-κB activation and interleukin-8 production［J］.Infect Immun，2006;74：1148-1155.

3 Meimarakis G，Winter H，Assmann I et al.Helicobacter pylori as a prognostic indicator after curative resection of gastric carcinoma：a prospective study［J］.Lancet Oncol，2006;7：211-222.

4 Marrelli D，Pedrazzani C，Berardi A et al.Negative Helicobacter pylori status is associated with poor prognosis in patients with gastric cancer［J］.Cancer，2009;115：2071-2080.

5 Matysiak-Budnik T，Mégraud F.Helicobacter pylori infection and gastric cancer［J］.Eur J Cancer，2006;42：708-716.

6 Xue L J，Su Q S，Yang J H et al.Autoimmune responses induced by Helicobacter pylori improve the prognosis of gastric carcinoma［J］.Med Hypotheses，2008;70：273-276.

7 Wilson K T，Crabtree J E.Immunology of Helicobacter pylori：insights into the failure of the immune response and perspectives on vaccine studies［J］.Gastroenterology，2007;133：288-308.

8 楊 霞，劉凱軍，申子剛et al.人Izumo蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞抗原表位預(yù)測［J］.中國免疫學(xué)雜志，2010;26(1)：37-40.

9 Jagusztyn-Krynicka E K，Godlewska R.New approaches for Helicobacter vaccine development difficulties and progress［J］.Pol J Microbiol，2008;57：3-9.

10 Molnar B，Galamb O，Sipos F et al.Molecular pathogenesis of Helicobacter pylori infection：the role of bacterial virulence factors［J］.Dig Dis，2010;28：604-608.

11 de Bernard M，Cappon A，Pancotto L et al.The Helicobacter pylori VacA cytotoxin activates RBL-2H3 cells by inducing cytosolic calcium oscillations［J］.Cell Microbiol，2005;7：191-198.

12 Sewald X，Gebert-Vogl B，Prassl S et al.Integrin subunit CD18 is the T-lymphocyte receptor for the Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin［J］.Cell Host Microbe，2008;3：20-29.

13 Torres V J，VanCompernolle S E，Sundrud M S et al.Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin inhibits activation-induced proliferation of human T and B lymphocyte subsets［J］.J Immunol，2007;179：5433-5440.

14 Sundrud M S，Torres V J，Unutmaz D et al.Inhibition of primary human T cell proliferation by Helicobacter pylori vacuolating toxin(VacA)is independent of VacA effects on IL-2 secretion［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004;101：7727-7732.

15 Ki M R，Hong I H，Park J K et al.Potent neutralization of vacuolating cytotoxin(VacA)of Helicobacter pylori by immunoglobulins against the soluble recombinant VacA［J］.Anticancer Res，2009;29：2393-2402.

16 Liu X L，Li S Q，Liu C J et al.Antigen epitope of Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin A［J］.World J Gastroenterol，2004;10：2340-2343.

17 Ghiara P，Rossi M，Marchetti M et al.Therapeutic intragastric vaccination against Helicobacter pylori in mice eradicates an otherwise chronic infection and confers protection against reinfection［J］.Infect Immun，1997;65：4996-5002.

18 Graessle S，Grabher G，Gapp G et al.Immune response to natural and recombinant antigens of Helicobacter pylori in patients with dyspeptic complaints［J］.Eur J Clin Microbiol Infect Dis，1999;18：636-642.

19 Malfertheiner P，Schultze V，Rosenkranz B et al.Safety and immunogenicity of an intramuscular Helicobacter pylori vaccine in noninfected volunteers：a phase I study［J］.Gastroenterology，2008;135：787-795.

20 Romi B，Soldaini E，Pancotto L et al.Helicobacter pylori induces activation of human peripheral γδ+T lymphocytes［J］.PLoS One，2011;6：e19324.

21 Dzierzanowska-Fangrat K，Raeiszadeh M，Dzierzanowska D et al.IgG subclass response to Helicobacter pylori and CagA antigens in children［J］.Clin Exp Immunol，2003;134：442-446.

22 Rautelin H I，Oksanen A M，Karttunen R A et al.Association of CagA-positive infection with Helicobacter pylori antibodies of IgA class［J］.Ann Med，2000;32：652-656.

23 Tanaka H，Yoshida M，Nishiumi S et al.The CagA protein of Helicobacter pylori suppresses the functions of dendritic cell in mice［J］.Arch Biochem Biophys，2010;498：35-42.

24 Arnold I C，Hitzler I，Engler D et al.The C-terminally encoded，MHC class II-restricted T cell antigenicity of the helicobacter pylori virulence factor caga promotes gastric preneoplasia［J］.J Immunol，2011;186：6165-6172.

25 白 楊，陳 燁，林煥建et al.幽門螺桿菌重組粘附素的安全性、免疫原性和生物學(xué)活性的體外評價(jià)［J］.第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003;23(9)：882-884.

26 Rad R，Gerhard M，Lang R et al.The Helicobacter pylori blood group antigen-binding adhesin facilitates bacterial colonization and augments a nonspecific immune response［J］.J Immunol，2002;168：3033-3041.