楊 錦 鄒斌斌 張玉祥 王澤生

(首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生物化學與分子生物學系)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)參與調(diào)控細胞代謝、增生、遷移和分化。其過度表達可加速細胞分裂與增生，抑制凋亡，有助于血管形成，并促進癌細胞轉(zhuǎn)移［1］。人類腫瘤包括非小細胞肺癌、乳腺癌、頭頸癌、胃癌、結(jié)腸癌、食管癌、前列腺癌、膀胱癌、腎癌、胰腺癌、口腔癌等都可表達或高表達EGFR［2］。腫瘤中的EGFR表達與疾病侵襲性增強、化療抵抗增加、轉(zhuǎn)移性增強，生存率下降及臨床預后差相關(guān)［3］。

egfr基因5'調(diào)控區(qū)包括1個富含GC的啟動子，缺少保守序列TATA盒和CAAT盒，有多個位點可以起始轉(zhuǎn)錄［4］。egfr啟動子在－216G/T存在多態(tài)性并與其增加活性相關(guān)［5］。深入了解egfr基因在腫瘤內(nèi)的表達調(diào)控將有助于我們對該基因的表達進行干預，并治療相應腫瘤。進行這類研究需要大規(guī)模、多樣本的基因組重測序。盡管第二代測序成本已明顯降低，但全基因組重測序需要大量的時間和高額的成本，制約其應用于疾病研究?；蚪M目標區(qū)域重測序策略不需對全基因組進行測序，只對基因或其他感興趣的基因組區(qū)域的基因序列重新測定。國際上已發(fā)表的研究報告［6－7］均采用商業(yè)公司推出的目標序列捕獲解決方案。本研究以宮頸癌細胞系HeLa S3 egfr啟動子為模型，建立了一套簡便易行的RNA捕獲靶序列的富集體系，結(jié)合Solexa測序方法，為各種復雜人類疾病相關(guān)突變的檢測奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1)細胞株:宮頸癌細胞系HeLa S3(購于北京協(xié)和細胞庫)。

2)主要試劑:RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司);胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Hyclone公司);MboI、Klenow Fragment、Klenow Fragment(3'→5'exo-)、T7 RNA Polymerase、rNTP(美國NEB公司); T4 DNA連接酶、Ex Taq(日本Takara公司);Biotin-11-dUTP(立陶宛Fermentas公司);Biotin-16-UTP(美國Ambion公司);Dynabeads M-280 Streptavidin(美國Invitrogen公司);DNA膠回收試劑盒、PCR純化試劑盒(德國Qiagen公司);引物合成單位(中國上海生工生物工程有限公司);高通量測序單位(北京六合華大基因科技股份有限公司深圳分公司)。

1.2 方法

1)細胞培養(yǎng):在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中，用含有10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基對HeLa S3細胞進行培養(yǎng)。

2)DNA文庫的制備:①細胞基因組的提取:8 000 g離心1 min，收集細胞，加入終濃度為0.5 μg/μL蛋白酶K，55℃消化過夜。消化16 h后再加入終濃度為0.2 μg/μL的RNase A，在37℃水浴30 min消化RNA，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，加入50 μL無菌水溶解。②MboⅠ酶切基因組:取基因組2 μg，50 μL體系中加入5 μL 10×NE Buffer2，加入5 U的限制性內(nèi)切酶MboⅠ，在37℃下水浴，消化過夜。65℃水浴20 min滅活限制性內(nèi)切酶活性。③DNA片段兩端加接頭:加入2 μL 10× NE Buffer2，加入終濃度為0.1 mmol/L的dNTP，加入Klenow Fragment(3'→5'exo-)15 U，在37℃水浴30 min。將體系擴大到100 μL，加入終濃度為1×T4 DNA連接酶緩沖液，加入終濃度為0.8 μmol/L的3'端‘T’突出的Pair-end adapter 1和Pair-end adapter 2(表1)，加入50 U的T4 DNA連接酶，16℃水浴過夜。④DNA片段的純化、回收:酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，加入15 μL無菌水溶解。所得DNA用1.5%瓊脂糖膠電泳，QIAGEN試劑盒膠回收400～1 000 bp DNA，加入100 μL無菌水溶解作為雜交模板。

3)生物素標記egfr啟動子片段的RNA制備和RNA/DNA雜交捕獲:①egfr啟動子片段兩端加T7，SP6 adapter:以基因組DNA為模板，用egfr promotor primer (表1)擴增egfr啟動子片段272 bp，液體回收后加上T7，SP6 adapter(表1)，用T7，SP6引物PCR擴增egfr啟動子片段，即得到帶有T7啟動子的egfr啟動子片段。②egfr啟動子片段轉(zhuǎn)錄為RNA:液體回收PCR產(chǎn)物，30 μL反應體系中含有4 mmol/L rNTP，1×T7 RNA Polymerase buffer，75 U T7 RNA Polymerase，0.3 mmol/L biotin-16-UTP，37℃水浴3 h。③egfr啟動子RNA/3C模板雜交: 200 μL反應體系中含有5×SSC buffer(0.75 mol/L NaCl，0.075 mol/L檸檬酸鈉)，加入DNA模板100 μL，95℃加熱2 min，冰上1 min，加入RNA 30 μL，65℃雜交24 h。④egfr啟動子片段富集:取鏈親和素包被的Dynal磁珠10 μL，用100 μL 2×B＆W緩沖液懸浮磁珠，加入100 μL的生物素化RNA/DNA，輕輕旋轉(zhuǎn)，室溫下放置過夜。用200 μL 1×TWB緩沖液洗3次，70℃加熱30 min，取上清，即得到生物素化的RNA/DNA(圖1)。

圖1 RNA捕獲法技術(shù)流程圖Fig.1 Schematic representation of RNA capture method

表1 PCR引物及接頭序列Tab.1 Sequence of pair-end adapters and PCR primers

4)樣本擴增和高通量測序:50 μL反應體系中含有0.4 mmol/L PE引物(表1)，0.2 mmol/L dNTPs，1.25 U Ex Taq DNA聚合酶，5 μL DNA模板。98℃變性30 s后，再依下列條件進行PCR:98℃變性10 s，62℃退火30 s，72℃延伸60 s，15個循環(huán)后，72℃延伸5 min。產(chǎn)物純化定量。RNA捕獲的樣本擴增15個循環(huán)后，進行Solexa高通量測序。

2 結(jié)果

2.1 MboⅠ酶切基因組DNA

結(jié)果顯示，MboⅠ酶消化的基因組DNA產(chǎn)生從大到小均一的酶切片段，與對照基因組相比，消化比較完全(圖2)。

圖2 MboⅠ酶切基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 MboⅠdigestion efficiency by gelelectrophoresis assay M：100 bp DNA ladder;1：HeLa S3 genome DNA treated by MboⅠ;2：HeLa S3 genome DNA untreated by MboⅠ with same quantity as control.

2.2 egfr啟動子片段轉(zhuǎn)錄為RNA

用T7 RNA Polymerase轉(zhuǎn)錄egfr啟動子272 bp，37℃水浴3 h后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可見egfr啟動子RNA呈彌散分布(圖3)。

圖3 T7 RNA Polymerase轉(zhuǎn)錄egfr啟動子片段瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gelelectrophoresis of egfr promotor DNA transcription by T7 RNA PolymeraseM：100 bp DNA ladder;1：egfr gene promotor DNA;2：egfr promotor RNA after transcription.

2.3 egfr啟動子片段富集的驗證

分別取富集前和富集擴增后的DNA模板12 ng作模板，用egfr promotor primer(表1)擴增，產(chǎn)物液體回收純化。瓊脂糖膠電泳結(jié)果顯示egfr啟動子片段經(jīng)過RNA雜交捕獲后有富集(圖4)。

2.4 Solexa高通量測序結(jié)果評價：測序結(jié)果Reads比對不同的基因分析

圖4 egfr啟動子片段PCR瓊脂糖凝膠電泳Fig.4 Agarose gelelectrophoresis of egfr gene promotor DNA PCRM：100 bp DNA ladder;1：egfr gene promotor PCR using template before enrichment;2：egfr gene promotor PCR using template after enrichment.

Solexa高通量測序結(jié)果的數(shù)據(jù)作為實驗組，用黑色表示，從實驗組中隨機取總條數(shù)為106reads，比對到egfr啟動子片段reads條數(shù)為1 889條，而比對到隨機挑選的notch 1、pdgf-B、src基因reads條數(shù)為2、3、3條。從人類全基因組隨機取總條數(shù)106的等長reads作為對照組，用白色表示，比對到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads條數(shù)分別為3，2，3，2條。橫坐標軸表示各基因名稱，縱坐標軸表示比對到各基因片段reads條數(shù)取log值。分析顯示，RNA捕獲法在本實驗中進行全基因組egfr啟動子片段富集了630倍(圖5)。

圖5 Reads比對不同的基因分析Fig.5 Analysis of Reads mapping different genes

3 討論

基因組測序分析能夠為基因DNA序列提供最真實可靠的信息，它可以比較全面地描述基因的復雜性和多樣性［8］。隨著人類基因組計劃的完成和測序技術(shù)的不斷發(fā)展，可以大規(guī)模地篩選突變基因，并對基因多態(tài)性進行檢測，有助于發(fā)現(xiàn)罕見的基因突變和腫瘤組織中基因組水平的變異［9］。但是在全基因組水平進行測序目前的費用還比較昂貴，一般課題組難以承受，基因診斷和治療技術(shù)的普及受到DNA富集方法的限制。本課題組采用RNA捕獲法將egfr啟動子片段轉(zhuǎn)錄為RNA，與基因組進行雜交富集，并洗去基因組的其他部分，用PCR擴增建立測序文庫，進行高通量測序并利用生物信息學技術(shù)進行分析，證明RNA捕獲法對egfr啟動子有明顯的富集作用。傳統(tǒng)的靶向重測序技術(shù)如PCR技術(shù)，費用過高或者通量過低［6］，該技術(shù)與之相比，具有一定的優(yōu)越性，它不存在偏向性，可以高效富集DNA，針對性強，簡便易行，且降低了測序成本。Nimbl Gen公司［10］推出的基于芯片雜交的全外顯子捕獲芯片，內(nèi)含210萬個寡核苷酸探針，可以捕獲人類大部分外顯子，通過測序識別在外顯子中的基因變異。Agilent公司［11］推出了基于芯片雜交和液相雜交的全基因組外顯子捕獲產(chǎn)品，捕獲探針的長度是120 bp，每管溶液中包含55 000個生物素化的RNA探針，Agilent公司還發(fā)展了在線eArray設計平臺，可以根據(jù)客戶需要自行設計探針。但是對于一般的研究單位而言，費用仍較高，需要提前訂購，在技術(shù)也并非簡便易行。

本技術(shù)利用RNA捕獲法，不僅可以對感興趣的靶區(qū)段自行設計，還可以自行制備生物素化的RNA探針，降低了成本。除了對外顯子或編碼序列設計探針外，還可以對感興趣的非編碼序列自行設計和制備RNA探針。本實驗RNA探針的長度達272 bp，而且在序列捕獲時采用較高溫度，提高了捕獲反應的特異性。本技術(shù)結(jié)合高通量技術(shù)深度測序所富集區(qū)域，而非全基因組序列，從而提高效率，降低成本。它可以用于大規(guī)模、多樣本的與疾病相關(guān)的基因和基因組水平異常的研究，包括單核苷酸多態(tài)性，基因組結(jié)構(gòu)變異，群體多態(tài)性，可變剪切等。該技術(shù)為研究人員提供了一種低成本、高效率、靈活的目標測序方法，可以適用于多種不同的應用領(lǐng)域，它的研究與發(fā)展將會在重大疾病研究中發(fā)揮重要作用。

［1］ Ciardiello F，Tortora G.EGFR antagonists in cancer treat-ment［J］.N Engl J Med，2008，358:1160－1174.

［2］ Salomon D S，Brandt R，Ciardiello F，et al.Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies［J］.Crit Rev Oncol Hematol，1995，19:183－232.

［3］ Tabernero J.The role of VEGF and EGFR inhibition:implications for combining anti-VEGF and anti-EGFR agents［J］.Mol Cancer Res，2007，5:203－220.

［4］ Brandt B，Meyer-Staeckling S，Schmidt H，et al.Mechanisms of EGFR gene transcription modulation:relationship to cancer risk and therapy response［J］.Clin Cancer Res，2006，12:7252－7260.

［5］ Liu W，Wu X，Zhang W，et al.Relationship of EGFR mutations，expression，amplification，and polymorphisms to epidermal growth factor receptor inhibitors in the NCI60 cell lines［J］.Clin Cancer Res，2007，13:6788－6795.

［6］ Mamanova L，Coffey A J，Scott C E，et al.Target-enrichment strategies for next-generation sequencing［J］.Nat Methods，2010，7:111－118.

［7］ Gnirke A，Melnikov A，Maguire J，et al.Solution hybrid selection with ultra-long oligonucleotides for massively parallel targeted sequencing［J］.Nat Biotechnol，2009，27: 182－189.

［8］ Shendure J，Ji H.Next-generation DNA sequencing［J］.Nat Biotechnol，2008，26:1135－1145.

［9］ Hillier L W，Marth G T，Quinlan A R，et al.Whole-genome sequencing and variant discovery in C.elegans［J］.Nat Methods，2008，5:183－188.

［10］Choi M，Scholl U l，Ji W，et al.Genetic diagnosis by whole exome capture and massively parallel DNA sequencing［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2009，106:19096－19101.

［11］Metzker M L.Sequencing technologies——the next generation［J］.Nat Rev Genet，2010，11:31－46.