劉俊，李霖，張曉燕

(揚州職業(yè)大學，江蘇揚州225009)

苯甲酸鈉(sodium benzoate，SB)又稱安息香酸鈉。隨著食品工業(yè)的發(fā)展，SB被廣泛應用于碳酸飲料、泡菜、醬油、食醋等食品中作為防腐劑。很多國家允許使用SB為食品防腐劑。過去曾認為SB對人體無毒，但最近的研究表明其可造成人體組織器官或機能的損壞，人體過量攝取會發(fā)生損壞肝臟甚至致癌等癥狀[1]，所以研究不同濃度的SB對生物細胞的損傷具有一定的意義。此外，很多種農(nóng)藥，包括殺蟲劑、除草劑和滅菌劑屬于或懷疑是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)(EDC，endocrine disruptors chemicals)類物質(zhì)，用于牙科修復的物質(zhì)——雙酚A，食品工業(yè)用的一些抗氧化劑如t－丁羥基茴香醚，以及塑料如芐丁基鄰苯二甲酸酯和4-羥基-烷基苯酚也被列入外源雌激素[2]。食品防腐劑苯甲酸鈉是否具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用，目前尚無明確報道。

草履蟲為單細胞生物，在水體中運動較快，能與周圍介質(zhì)充分接觸，與多細胞生物相比，對毒性的反應更為靈敏，且宜采集、培養(yǎng)。用它來研究SB對細胞的毒害及環(huán)境雌激素作用是比較理想的實驗料[3]。本研究旨在通過苯甲酸鈉對草履蟲的急性和慢性毒性作用研究，探索苯甲酸鈉的毒性作用和環(huán)境雌激素作用。

1 材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗用草履蟲采集于揚州市西區(qū)生活污水河的尾草履蟲。

1.1.2 藥品

苯甲酸鈉(分析純，上海光華化學試劑廠)。

1.2 主要儀器

XSP－13A顯微鏡，解剖鏡，LRH-250-CT光照培養(yǎng)箱，微樣移液器。

2 實驗方法

2.1 草履蟲純化培養(yǎng)與計數(shù)

采用郭峰等[4]微量分離法。用50μL微量加樣器取富集到的草履蟲樣液，在干凈玻片上一排滴5滴，每滴10μL，在5×10倍鏡下鏡檢，將含草履蟲的那一滴水轉(zhuǎn)吸到另一塊干凈載玻片上，加10μL稻草培養(yǎng)液，1∶1稀釋變成20μL，用微量加樣器在同一塊載玻片上再將其分成2滴，每滴10μL，鏡檢，將含有草履蟲的那一滴再加10μL稻草培養(yǎng)液再次1∶1稀釋變成20μL，如此重復稀釋3～5次，直到在10×100的高倍鏡下鏡檢確認已無其他生物為止。最后，將含有草履蟲的那一滴吸入含250mL稻草培養(yǎng)液的三角燒瓶中室溫培養(yǎng)1周左右，取5滴各含10μL鏡檢，若除草履蟲外仍有少數(shù)其他生物，可重復用上述微量分離方法再次進行分離純化。

2.2 攻毒實驗

用稻草培養(yǎng)液配制苯甲酸鈉系列稀釋液。通過逼近實驗確定最小致死劑量和絕對致死劑量。在此范圍內(nèi)設置8個苯甲酸鈉濃度組:8g·L－1、9g·L－1、10g·L－1、11g·L－1、12g·L－1、13g·L－1、14g·L－1、15g·L－1、16g·L－1、17g·L－1、18g·L－1、19g·L－1，以稻草培養(yǎng)液做空白對照，培養(yǎng)體積100μL，每管10個草履蟲，光照培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)。急性毒性實驗培養(yǎng)1h，慢性毒性實驗培養(yǎng)72h和168h。(SB濃度為10g·L－1、9g·L－1、8g·L－1、7g·L－1、6g·L－1、5g·L－1、4g·L－1、3g·L－1、2g·L－1、1g·L－1、0.8g·L－1、0.6g·L－1、0.4g·L－1、0.2g·L－1)計數(shù)存活草履蟲個體數(shù)。

2.3 數(shù)據(jù)分析及設計方法

急性毒性實驗數(shù)據(jù)處理:根據(jù)百分率與概率單位對照表，將死亡率轉(zhuǎn)換成概率單位;概率單位為Y1，濃度對數(shù)為X1，應用SPSS軟件對概率單位(Y1)與濃度對數(shù)(X1)進行回歸分析，得到回歸方程Y1=a1X1+b1，計算LC50。

慢性毒性實驗數(shù)據(jù)處理:草履蟲的種群增長速率計算公式:Y2(或Y3)=(lnNt－lnN0)·t－1，其中N0為草履蟲的起始種群密度，Nt為t(h)時草履蟲的種群密度，t為培養(yǎng)持續(xù)時間(h)。起始種群密度N0=起始個體數(shù)/培養(yǎng)液總體積;t(h)時種群密度Nt=t(h)時個體數(shù)/培養(yǎng)液總體積;應用SPSS軟件對種群增長速率(Y2或Y3)與濃度對數(shù)(X2或X3)進行回歸分析，得到回歸方程Y2=a2X2+b2及Y3=a3X3+b3，分析草履蟲種群增長率與苯甲酸鈉濃度間關系。

3 實驗結(jié)果

3.1 急性毒性實驗

3.1.1 最小致死劑量和絕對致死劑量

最小致死劑量是指在一群生物中僅引起個別生物死亡的最低劑量，低于此劑量時就不能使機體出現(xiàn)死亡。絕對致死劑量是指引起實驗生物全部死亡的最低劑量。經(jīng)過多次逼近試驗得出:苯甲酸鈉對草履蟲1h急性毒性最小致死劑量為8g·L－1，絕對致死劑量為19g·L－1。

3.1.2 半數(shù)致死濃度

半數(shù)致死濃度是使一群受試生物50%死亡的最低濃度。苯甲酸鈉梯度濃度對草履蟲1 h急性毒性實驗結(jié)果見表1。以校正死亡率對應幾率值(Y1)與濃度對數(shù)(X1)進行回歸分析，得到回歸方程Y1=10.051X1－6.563，(R2=0.965)，即濃度對數(shù)(X1)與幾率值(Y1)之間呈線性關系，濃度越大，死亡率越高。并根據(jù)回歸方程求得Y1=5時(死亡率50%)，苯甲酸鈉對草履蟲的1h LC50為14.14g·L。

表1 苯甲酸鈉對草履蟲的1h急性毒性作用結(jié)果

3.2 72h(三天)慢性毒性實驗

表2 苯甲酸鈉對草履蟲的72h慢性毒性作用結(jié)果

草履蟲72h慢性毒性實驗結(jié)果如表2所示。種群增長率(Y2)和濃度對數(shù)(X2)之間呈線性關系，其回歸方程為Y2=－0.0153X2+0.0347(R2=0.480)，即濃度在0.8－5g·L－1范圍內(nèi)，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小;但是，如圖1所示，在低濃度范圍(0.2－0.8g·L－1)內(nèi)種群增長率有逐漸上升趨勢;在濃度5g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;濃度大于5g·L－1時，種群增長率又有一定上升趨勢。

3.3 168h(一周)慢性毒性實驗

草履蟲一周慢性毒性實驗結(jié)果如表3所示，種群增長率(Y3)和濃度對數(shù)(X3)之間的回歸方程為Y3=－0.00884X3+0.0155(R2=0.391;P＜0.05)。即濃度在0.6－6g·L－1范圍內(nèi)，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小。在中低等濃度范圍內(nèi)(0.2－0.6g·L－1)濃度對數(shù)越大，種群增長率呈緩慢增加趨勢，在濃度6g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;濃度大于6g·L－1時，種群增長率又有一定上升趨勢。

表3 苯甲酸鈉對草履蟲的168h慢性毒性作用結(jié)果

圖1 苯甲酸鈉對草履蟲的慢性毒性作用結(jié)果

4 討論

本實驗中關于急性毒性研究的結(jié)果顯示:苯甲酸鈉溶液的濃度越高，草履蟲的死亡率越高。這與有關原生動物的急性毒性研究報道結(jié)果相似。王莉霞等[5]研究表明，氰戊菊酯對原生動物群落的48h半致死濃度LC50為15.83mg·L－1，劉慶余等[6]研究顯示，乙氰菊酯對草履蟲的1h急性毒性實驗，以甲苯為助溶劑時LC50為16.3mg·L－1，以丙酮為助溶劑時LC50為24.0mg·L－1。李霖[7－9]結(jié)果表明，三氟氯氰菊酯對草履蟲1h急性毒性LC50為1.648mg·L－1;多菌靈對草履蟲的1h LC50為0.5340mg·L－1，毒死蜱對尾草履蟲的1h LC50為0.04359mg·L－1。本實驗結(jié)果表明，苯甲酸鈉對草履蟲1h急性毒性LC50為1.103 g·L－1，顯示草履蟲對苯甲酸鈉的敏感性遠遠小于菊酯、毒死蜱等農(nóng)藥，說明苯甲酸鈉的毒性作用是很低的，但是濃度越大，死亡率越高，表明隨著苯甲酸鈉濃度的逐步升高，其生物毒性也逐步加大。

兩組慢性攻毒實驗結(jié)果都顯示種群增長率和濃度對數(shù)之間呈線性關系，濃度對數(shù)越大，種群增長率越小，即濃度越大，對種群增長抑制作用越強。與1h急性毒性作用比較，苯甲酸鈉對草履蟲的最小全致死效應濃度隨著毒性作用時間延長而降低，表明苯甲酸鈉對草履蟲的毒性作用既具有劑量效應，又具有時間效應。

值得注意的是72h、168h慢性毒性試驗顯示，在偏低濃度范圍時，種群增長率大于對照組;種群增長率隨著濃度的增加呈現(xiàn)逐漸上升趨勢;在中等濃度范圍內(nèi)，種群增長率隨著濃度的增加呈現(xiàn)逐漸下降趨勢;在濃度5g·L－1、6 g·L－1時種群增長率急劇下降為最低值;在越過最低值后又出現(xiàn)一定范圍內(nèi)隨濃度升高而明顯上升的趨勢。這一現(xiàn)象說明，苯甲酸鈉在一定濃度范圍內(nèi)對草履蟲生殖具有促進作用。

EDC是對生物的繁殖、發(fā)育、行為及保持動態(tài)平衡的體內(nèi)天然激素的合成、分泌、傳輸、結(jié)合和清除起干擾作用的外源物質(zhì)。EDC具有不尋常的量效效應，，傳統(tǒng)的毒性閾值概念并不適合它。Vom[10]等報道在一定劑量范圍內(nèi)，低劑量EDC促進某種效應，而高劑量的EDC卻產(chǎn)生抑制作用，形成“U”形量效曲線。李霖等[7－9]研究顯示三氟氯氰菊酯、多菌靈、毒死蜱對草履蟲慢性毒性作用在一定低濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)出濃度越大，種群增長率越高的現(xiàn)象，認為這種促進可能是具有環(huán)境內(nèi)分泌干擾物作用的一種體現(xiàn)。本結(jié)果與其類似，尤其與三氟氯氰菊酯的作用相似，在中等濃度時濃度越高，對種群增長率的抑制作用越強，在越過最低值后種群增長率有逐漸上升趨勢，濃度越高，對種群增長的促進作用越強。由此提示，草履蟲種群增長率與苯甲酸鈉濃度間具有顯著的反應—劑量關系。這種反應—劑量關系與環(huán)境雌激素效應非常相似。苯甲酸鈉是否具有環(huán)境雌激素的效應，還需通過進一步研究方可定論。

此外，慢性毒性還顯示在高濃度平行組中，出現(xiàn)個別組種群增長率顯著增加而其他組全部死亡的現(xiàn)象。有可能是由于草履蟲對環(huán)境雌激素效應的應答具有一定個體差異，關于環(huán)境雌激素效應的機理還需進一步研究。

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