趙金紅,許金鵬,李朝品

(1.皖南醫(yī)學(xué)院 人體寄生蟲學(xué)教研室,安徽 蕪湖 241002;2.安徽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 檢驗科,安徽 合肥230031)

血紅素又稱鐵卟啉,由原卟啉Ⅸ與一個鐵離子絡(luò)合而成,廣泛存在于動物的血液、肌肉和某些植物組織中,是血紅蛋白、肌紅蛋白、細胞色素C、過氧化氫酶和過氧化物酶等的輔基。在血液中,血紅素主要存在于紅細胞內(nèi),一分子珠蛋白與四分子血紅素以非共價鍵結(jié)合構(gòu)成血紅蛋白。血紅素具有重要的生理功能和較高的應(yīng)用價值,在醫(yī)藥、食品、化工、保健品、建筑及化妝品行業(yè)中有廣泛應(yīng)用。目前,從動物抗凝血液中提取血紅素的工藝優(yōu)化研究較多[1～5],利用非抗凝豬血(血凝塊)提取血紅素工藝尚未見報道。因非抗凝豬血的獲取、保存、運輸更為便利,故本研究以非抗凝豬血為原料,對血紅素的提取及其優(yōu)化工藝進行初步研究,現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 新鮮非抗凝豬血(蕪湖城南屠宰場),丙酮、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇等(國產(chǎn)分析純),血紅素標(biāo)準品(Sigma公司,純度≥98.0%);高速組織搗碎機(上海標(biāo)本模型制造廠,DS-1),超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司,JY96-Ⅱ),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠,RE-2000),循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司,SHB-Ⅲ),紫外分光光度計(蘇州島津,UV-2550)。

1.2 血紅素的提取工藝 將1 kg新鮮非抗凝豬血,高速組織搗碎機勻漿5 min,加入等體積雙蒸水,用超聲波細胞粉碎機,以200W功率破碎10 min,再加入1%鹽酸丙酮溶液(即V鹽酸丙酮∶V溶血液﹦5∶1),混勻,用1 mol/L鹽酸調(diào)pH值至2～3(此時血紅素與珠蛋白結(jié)合最為疏松),攪拌抽提10 min,血紅素與珠蛋白分離溶于鹽酸丙酮溶液中,而珠蛋白變性沉淀,以4 000 r/min離心15 min,收集含血紅素的鹽酸丙酮上清,抽濾除去珠蛋白顆粒。濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸餾回收丙酮,血紅素析出,離心收集沉淀,將沉淀用0.1 mol/L NaOH溶液溶解(血紅素溶于稀NaOH溶液),離心除去不溶性的珠蛋白雜質(zhì),收集上清液,再以1 mol/L鹽酸調(diào)pH值5～6,血紅素重新沉淀析出,離心,收集沉淀,分別用雙蒸水和無水乙醇洗滌2次,干燥即得血紅素,稱重,并計算產(chǎn)率。

1.3 血紅素樣品的定性測定 紫外-可見吸收光譜法:將血紅素標(biāo)準品與提取的血紅素樣品105℃干燥至恒重,準確稱量干燥好的血紅素標(biāo)準品和樣品,用0.1 mol/L NaOH溶液溶解,制成濃度為200 mg/L的標(biāo)準品和樣品溶液的母液備用。再分別制成10.0 mg/L的稀溶液,用紫外分光光度計于300～700 nm波長范圍內(nèi)掃描。

1.4 血紅素樣品的含量和純度測定

1.4.1 血紅素標(biāo)準曲線的繪制 以0.1 mol/L NaOH溶液為空白,用紫外分光光度計于最大吸收波長389 nm處測定不同濃度的血紅素標(biāo)準品溶液的吸光度。以血紅素標(biāo)準品溶液的濃度為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準曲線,計算回歸方程。

1.4.2 血紅素的精密度和回收率

1.4.2.1 精密度 量取血紅素標(biāo)準品母液,制成8.0 mg/L的標(biāo)準品溶液,在389 nm處測定其吸光度,計算相對標(biāo)準偏差(RSD)結(jié)果。

1.4.2.2 回收率 量取9份血紅素樣品母液2.0 ml,分為3組。每組分別加入血紅素標(biāo)準品母液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml,用0.1 mol/L NaOH溶液定容至100 ml,測定結(jié)果作為樣品加入量和標(biāo)準品加入量。此外,另分別移取血紅素樣品母液2.0 ml和血紅素標(biāo)準品母液1.0 ml、2.0 ml、3.0 ml,用0.1 mol/L NaOH溶液定容至100 ml,測定結(jié)果作為樣品加入量和標(biāo)準品加入量。在389 nm處分別測溶液的吸光度值,代入回歸方程計算加樣回收率。

1.4.3 血紅素樣品的含量和純度測定 制濃度為8.0 mg/L的血紅素樣品溶液,以0.1 mol/L NaOH溶液為空白,在389 nm波長處測得吸光度,代入回歸方程,計算出8.0 mg/L的血紅素樣品溶液中血紅素含量,并利用純度計算公式計算提取的血紅素樣品的純度。

1.5 正交試驗對血紅素提取工藝的優(yōu)化 血紅素的提取受多種因素影響,根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果和文獻報道影響血紅素產(chǎn)率的因素,本研究選擇非抗凝血的勻漿時間、勻漿后雙蒸水加入量、加入的鹽酸丙酮溶液與溶血液的體積比(V鹽酸丙酮∶V溶血液)和攪拌抽提時間4個因素,每個因素3個水平(表1),運用L9(34)正交表,每次以0.5 kg非抗凝豬血為原料,進行正交試驗,以血紅素的產(chǎn)率(%)為指標(biāo),探討非抗凝豬血提取血紅素的最佳提取條件和參數(shù)。

表1 血紅素提取的正交試驗因素-水平表Tab 1 Factors and levels of orthogonal experiment in heme extraction

2 結(jié)果

2.1 血紅素樣品的一般性質(zhì)和產(chǎn)量 提取的血紅素為黑紫色粉末狀固體,易溶于稀NaOH溶液和酸性丙酮溶液,不溶于蒸餾水和無水乙醇,105℃不熔解。該法提取血紅素的平均產(chǎn)量為10.6 g/kg非抗凝豬血,平均產(chǎn)率為1.06%。

2.2 血紅素的定性結(jié)果 紫外-可見吸收光譜法結(jié)果顯示,于300～700 nm波長范圍內(nèi),血紅素樣品與標(biāo)準品的的光譜圖基本一致,在340 nm、389 nm、578 nm、603 nm波長處顯示吸收峰,最大吸收峰在389 nm處(圖1)。

圖1 血紅素標(biāo)準品與樣品的紫外-可見吸收光譜圖Fig 1 Ultraviolet-visible absorption spectrum of heme samples and standard substance

2.3 血紅素樣品的含量和純度 血紅素標(biāo)準曲線的回歸方程為y=0.0891χ-0.0064(R2=0.9996),相關(guān)系數(shù)趨近于1。該回歸方程可用于計算血紅素樣品中血紅素的含量。平均吸光度值為0.699,RSD=0.72%(n=6),平均回收率為100.27%,RSD=0.73%(n=9),表明該法測定血紅素精密度、回收率良好。

經(jīng)計算,血紅素樣品溶液中血紅素含量為7.12 mg/L,純度為90.8%。

2.4 正交試驗對非抗凝豬血提取血紅素工藝優(yōu)化的結(jié)果 通過對以上正交試驗結(jié)果進行分析可以得出:極差(R)C>B>A>D(表2),表明V鹽酸丙酮∶V溶血液對非抗凝血提取血紅素產(chǎn)率影響最大,其后影響大小依次為:雙蒸水加入量、勻漿時間、攪拌抽提時間。最佳工藝參數(shù)為:C3>B2>A2>D3,即鹽酸丙酮溶液與溶血液的體積比(V鹽酸丙酮∶V溶血液)為5∶1,勻漿后雙蒸水加入量為加入等體積雙蒸水,非抗凝血的勻漿時間為5 min,攪拌抽提15 min。

表2 非抗凝豬血提取血紅素的L9(34)正交試驗結(jié)果Tab 2 Results of L9(34)orthogonal experiment for heme extracted from non-anticoagulated blood

3 討論

近年來,許多發(fā)達國家,如美國、日本、英國、德國等先后利用動物血液,生產(chǎn)食品添加劑、保健品及藥品等。2000年2月,國家經(jīng)貿(mào)委結(jié)合市場需求和技術(shù)現(xiàn)狀,會同有關(guān)部門和單位,提出了要綜合利用我國屠宰資源,利用動物血液、臟器等提取凝血酶、超氧化物歧化酶等動物生化藥物。由于動物生化藥物具有針對性強、毒副作用小、顯效快、易于吸收和代謝等優(yōu)點,因此利用動物血液等生物資源研制高活性生化藥物已成為我國藥物開發(fā)的重要組成部分[6]。我國動物血液資源十分豐富,估計每年在2.3×106噸以上,其中每年豬血總量約有150萬噸,除極少量用于制作血豆腐或飼料外,大部分被廢棄,造成資源浪費和環(huán)境污染[7]。如果能夠綜合開發(fā)利用豬血資源提取血紅素,既可以減少環(huán)境污染,又可以增加豬血的經(jīng)濟效益和社會效益[8]。由抗凝血提取血紅素的技術(shù)已漸趨成熟,而非抗凝血提取血紅素的相關(guān)報道甚少[9]。

在紅細胞內(nèi),四分子血紅素與一分子珠蛋白以非共價鍵緊密結(jié)合,構(gòu)成血紅蛋白,并且血紅蛋白在丙酮中易變性而空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,當(dāng)pH值<3時,血紅素中的鐵與珠蛋白結(jié)合最為疏松。實驗中將非抗凝豬血勻漿和超聲波溶血,紅細胞中的血紅蛋白釋出,通過加入丙酮并調(diào)pH值至3.0左右,此時血紅素與珠蛋白分離溶于酸性丙酮溶液中,珠蛋白等變性沉淀,回收丙酮,血紅素濃縮析出。本研究根據(jù)預(yù)試驗的結(jié)果采用正交試驗對非抗凝血提取血紅素的工藝進行優(yōu)化,選擇非抗凝血的勻漿時間、勻漿后雙蒸水加入量、加入的鹽酸丙酮溶液與溶血液的體積比(V鹽酸丙酮∶V溶血液)和攪拌抽提時間4個因素,分別研究了其對原卟啉產(chǎn)率的影響,確定了最佳提取工藝為:C3>B2>A2>D3,即非抗凝血的勻漿時間為5 min,勻漿后雙蒸水加入量為加入等體積雙蒸水,1%鹽酸丙酮溶液加入量為溶血液體積的5倍,攪拌抽提時間為15 min。

本研究以非抗凝豬血為原料提取血紅素,原料獲取、保存、運輸更為便利,制備過程中減少了中間產(chǎn)物,簡化了操作步驟,制備周期大大縮短,且所用的丙酮又可經(jīng)蒸餾回收而重復(fù)利用,既降低了制備成本,又減少了其對環(huán)境的污染;分離的珠蛋白等血液蛋白還可以進一步開發(fā)利用,如制作飼料或蛋白粉等?？梢?以非抗凝豬血為原料制備血紅素,綜合開發(fā)利用了豬血資源,減少了環(huán)境污染,具有一定的應(yīng)用價值和較好的市場前景。

[1]胡美琴,余蓉.用PEG6000從新鮮豬血中分離提取豬血紅蛋白[J].華西藥學(xué)雜志,2008,23(3):329-330.

[2]馬永征,宋宏新,李敏康.氯化血紅素提取中超聲波細胞破碎條件的研究[J].陜西科技大學(xué)學(xué)報,2005,23(2):41-44.

[3]賀峰,史先振.鴨血中提取血紅素的研究初報[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2008,142(7):206-209.

[4]鐘耀廣.利用冰醋酸提取血紅素的研究[J].食品科學(xué),2004,25(4):90-95.

[5]瞿桂香,黃耀江,董明盛.血紅素制備工藝研究進展[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2007,16(1):19-22.

[6]刁治民,杜軍華,馬壽福.動物血液的開發(fā)利用[J].青?？萍?2000,9(3):7-10.

[7]馮詠梅,王文華,陳小平.豬血制品的研究與開發(fā)[J].食品研究與開發(fā),2002,23(6):71-73.

[8]趙金紅,許金鵬,李朝品.利用血紅素制備原卟啉鈉的工藝優(yōu)化研究[J].皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,30(1):11-13,30.

[9]許金鵬,李朝品.利用動物血液制備的原卟啉鈉研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2009,30(10):78-81.