清氣化痰湯對急性肺損傷小鼠水通道蛋白1表達的影響*

鄧青南 周建龍 郭振輝

廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院（廣東廣州510010）

內毒素性急性肺損傷（ALI）臨床上表現(xiàn)為肺水腫及肺不張引起的呼吸急促，如果得不到及時有效的治療，最終將會形成急性呼吸窘迫綜合征，造成機體不可逆的急性呼吸功能衰竭?，F(xiàn)代醫(yī)學主要是采取大劑量激素沖擊療法配合細胞因子拮抗劑，中性粒細胞蛋白分解酶抑制劑，抗氧化劑等方法，療效欠佳。中藥治療內毒素性肺損傷有其獨特優(yōu)勢，目前主要為清熱解毒、活血化瘀等方法［1-2］。自第一個水通道蛋白AQP1被發(fā)現(xiàn)以來，有關AQP的分布及其維持細胞內外穩(wěn)態(tài)平衡中的作用日益受到重視。本實驗通過脂多糖（LPS）復制ALI模型，探討清氣化痰湯和AQP1的相關性及清氣化痰湯治療ALI的機制。

1 材 料

健康昆明種小鼠24只，雄性，體質量18～20g，由廣東省動物實驗中心提供。脂多糖（LPS，美國Sigma公司）； AQP1、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細胞介素 1β（IL-1β）引物由上海生工提供。RNA提取及逆轉錄試劑盒（美國Promega公司）。清氣化痰湯組成：瓜蔞仁 18g，杏仁 18g，枳實 18g，陳皮 18g，黃芩 18g，茯苓18g，制半夏27g，膽南星27g（由廣州軍區(qū)總醫(yī)院藥劑科提供，自行煎制）。

2 方 法

2.1 ALI動物模型制備 將24只小鼠隨機平均分為空白對照組，模型對照組，清氣化痰湯組。給小鼠腹腔注射質量濃度為200μg/mL的 LPS（10mg/kg）建立 ALI模型，對照組予以等量的生理鹽水作為對照。在6h時間點處死小鼠，并立即解剖肺組織，左上肺進行濕重/干重比（w/d）檢測，左中下行石蠟包埋，并制成病理切片。右肺制成肺組織勻漿行PCR檢測。

2.2 w/d的測定與肺組織病理觀察 稱取左上肺濕重 （w）后，置70℃恒溫箱，24h后稱干重（d），計算w/d。肺組織經過10%的甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察ALI的病理變化。

2.3 RT-PCR檢測肺組織AQP1、TNF-α、IL-1β的mRNA表達。引物序列分別為：AQP1上游引物：CTGGCCTTTGGTTTGAGCGT，AQP1下游引物：CCACACACTGGGCGATGAT，片段長度為149bp；TNF-α 上游引物：AGCCGATGGGTTGTA，TNF-α 下游引物：ACTTGGGCAGATTGA，片段長度為266bp；IL-1β上游引物：GCTTCAGGCAGGCAGTAT，IL-1β 下游引物：ACAAACCGCTTTT CCATCT， 片段長度為 475bp；β-actin上游引物：CTGTCCCTGTATGCCTCTG，IL-1β 下游引物：ATGTCACGCACGATTTCC，片段長度為 218bp；AQP1的 PCR擴增條件：94℃變性 55s，53.5℃退火 56s，72℃延伸 55s，循環(huán) 35 次，72℃擴增 5min，TNF-α 的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。IL-1β的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。β-actin的退火溫度為53.5℃，其余條件相同。長波紫外燈下觀察并照相，Bio Rad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，Quantity One圖像分析軟件計算 AQP1、TNF-α、IL-1β 的 mRNA與 βactin mRNA比值。

2.3 統(tǒng)計學處理 應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以表示，組間差異的比較采用one-way ANOVA方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結 果

3.1 肺大體觀察 空白對照組、清氣化痰湯組肺外觀均無明顯異常改變。模型對照組肺體積增大，暗紅色，散在有大小不一紅色斑點，切片疏松，有淡紅色液體滲出。

3.2 肺病理觀察 空白對照組、清氣化痰湯組光鏡下示肺泡結構清晰完整，無明顯異常。模型對照組光鏡下肺泡壁充血增厚，肺泡間隔增寬，腔內有少許出血、滲出及炎性細胞浸潤，肺間質充血水腫，有大量炎性細胞浸潤（見圖1）。

圖1 各組肺病理組織圖（HE染色）

3.3 肺w/d 模型對照組的肺w/d值較空白對照組顯著升高（P＜0.01），清氣化痰湯組較模型對照組均明顯改善（P＜0.05）（見表 1）。

3.4 AQP1mRNA、TNF-αmRNA和 IL-1βm RNA的表達 RTPCR檢測結果顯示：模型對照組大鼠肺組織AQP1 mRNA的表達較空白對照組明顯降低 （P＜0.01），清氣化痰湯組肺組織AQP1 mRNA的表達較模型對照組明顯回升（P＜0.05）。模型對照組大鼠肺組織TNF-αmRNA的表達較對照組明顯升高 （P＜0.05），清氣化痰湯組肺組織TNF-αmRNA的表達較模型對照組明顯降低（P＜0.05）（見表 2，圖 2）。

表1 各組w/d比值的比較

表1 各組w/d比值的比較

與模型對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

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圖2 PCR電泳結果

表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達比較

表 2 各組 AQP1、TNF-α、IL-1βmRNA 表達比較

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4 討 論

嚴重感染是最常見的原因，其中內毒素性ALI是臨床上常見的危重病癥，許多疾病都容易并發(fā)內毒素性ALI。其病理特征主要是肺組織水腫及肺不張，細胞上表現(xiàn)為多種炎性因子和炎癥介質的過度釋放，促炎抗炎反應失衡。近年研究表明，肺臟的液體平衡遭到破壞，通透性增高導致產生肺水腫與水通道蛋白密切相關。中醫(yī)學認為感染、炎癥等多屬溫熱病范疇。肺為嬌臟，為五臟之華蓋，病邪入侵，常先傷肺，邪毒壅肺，肺失宣降，氣不布津，又致病理產物內聚，機體炎癥反應加重，病變由肺而累及全身，這與現(xiàn)代醫(yī)學對于發(fā)生發(fā)展過程的認識甚為相似。中藥或復方常常是多成分、多靶點、多途徑、多機制發(fā)揮作用，對于綜合調控復雜的炎癥反應更具優(yōu)勢［3］。

AQPs是對水有特異性轉運功能的細胞膜通道蛋白，人類和哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有10個亞型，分布在肺、腎、眼部。其中已知在肺組織和氣道至少有 4 種 AQPs （AQP1、AQP3、AQP4、AQP5）表達并參與肺液體轉運，其中，與肺損傷關系最密切的研究主要以AQP5和AQP1為主。

AQP1主要在氣道周圍毛細血管、淋巴管及肺泡毛細血管內皮細胞和臟層胸膜間皮細胞上表達，主要負責清除支氣管和脈管周圍組織的內水分［4］。AQP5主要表達在肺泡Ⅰ型上皮細胞及氣道分泌上皮頂質膜，作用主要是清除肺泡腔內水分［5］。AQP1、AQP5特異性地轉運水分子，其他溶質和分子則不能通過，有效維持血管與間質之間水平衡［4］。與野生型小鼠相比，AQP1或AQP5基因敲除小鼠肺泡毛細血管間水的滲透性、通透性均降低約10倍。AQP1和AQP5均敲除小鼠肺泡毛細血管間水的滲透性、通透性降低約25～30倍左右［6-7］。AQPs在各種原因形成的肺損傷肺水腫中起重要作用。腺病毒感染小鼠毒造成病毒性肺炎，肺水明顯增加，在病毒感染后7d和14d分別檢測AQP1和AQP5，發(fā)現(xiàn)兩者表達量均有顯著降低，但在14天時AQP1的表達有所回升，同時與炎癥反應減輕相一致，提示AQPs的減少可能是肺水在肺間質聚集的重要原因，表明AQPs可能在病毒感染后的肺水腫中起主要作用［8］。譚利平［9］研究發(fā)現(xiàn)，與空氣對照組相比，高氧暴露不同時間后，AQP5特異性表達部位保持不變，但隨暴露時間延長，AQP5表達呈逐漸減弱趨勢，推測高氧肺損傷時AQP5表達降低，可能是高氧肺損傷肺水腫形成的原因之一。ALI/ARDS病理過程中，AQP1、5表達下調，肺泡-毛細血管間水轉運障礙，導致液體在肺泡腔、肺間質的積聚，從而使肺泡腔、肺間質水腫加重，可能參與了肺水腫時液體的異常轉運。研究發(fā)現(xiàn)肺損傷后AQP1、5在調節(jié)肺內液體平衡中起一定作用，可能參與了肺水腫的發(fā)病機制［10］。高巨［11］首次觀察到失血性休克和內毒素刺激下大鼠肺組織AQP5的蛋白表達水平明顯下調，肺組織損傷嚴重，提示二次打擊后機體清除肺間質和肺泡腔過多水分的能力明顯減弱，肺泡-毛細血管膜水通透性顯著降低。與此相對應，二次打擊后該組的肺組織含水量也明顯增加。

本實驗中，模型對照組大鼠w/d值較空白對照明顯增大，出現(xiàn)肺間質水腫同時AQP1表達明顯下調，經清氣化痰湯治療后，大鼠肺損傷肺水腫改善，同時AQP1表達上調。炎癥因子TNF-α、IL-1β的表達與AQP1表達結果相反。實驗證明肺水腫吸收障礙可能有與AQP1表達下調有關。清氣化痰湯可通過增加肺毛細血管和淋巴管AQP1的表達，提高肺間質水腫液的跨內皮轉運，促使水從肺間質回流到血管系統(tǒng)，進而促進肺水腫的吸收，可達到治療ALI的目的。本研究發(fā)現(xiàn)清氣化痰湯上調AQP1的表達，可能是通過下調TNF-α、IL-1β等表達實現(xiàn)的。

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［3］ 劉建新，余林中.中藥保護急性肺損傷作用機理研究進展［J］.陜西中醫(yī)學院學報，2009，11（6）：83-85.

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［10］謝艷萍.急性肺損傷大鼠肺水通道蛋白1和5的表達及功能的實驗研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2005，28（6）：385-400.

［11］高巨.“失血性休克-內毒素”二次打擊所致肺損傷水通道蛋白的表達［J］.中國急救醫(yī)學，2007，27（6）：546-548.