日本七鰓鰻Arg-Gly-Asp毒素蛋白Lj-RGD3野生型與RGD全缺失突變體Lj-112的抗血管新生作用

王繼紅，張亞前，呂莉，劉欣，李慶偉

1 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029

2 遼寧省生物技術(shù)與分子藥物研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116029

3 大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，大連 116044

七 鰓 鰻 Lampetra japonica 屬 圓 口 綱Cyclostomata、七鰓鰻目、七鰓鰻科、七鰓鰻屬，是迄今發(fā)現(xiàn)的最古老的無(wú)頜脊椎動(dòng)物[1]。其為海洋洄游性魚類，成體在海洋中用吸盤附在其他魚體上吸食血肉而營(yíng)半寄生生活。由于日本七鰓鰻可使被其所吸附的魚血流不止，所以可以斷定七鰓鰻口腔腺分泌物中具有抗凝血成分，其基因?yàn)楠?dú)有的特化基因。鑒于此，本課題組從前期研究工作中發(fā)現(xiàn)了一條存在于七鰓鰻口腔腺的含有 3個(gè) RGD (Arg-Gly-Asp)模體的毒素蛋白Lj-RGD3[2]。

RGD毒素蛋白為一類含 RGD (Arg-Gly-Asp)模體的來(lái)源于吸血或有毒生物唾液腺的分泌蛋白，其可憑借蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)上特有的RGD分子序列而成為細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞整合素間結(jié)合的強(qiáng)效競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，進(jìn)而通過(guò)封閉整合素細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而起到抑制血小板聚集、抑制血管新生和抗腫瘤細(xì)胞增殖等作用。迄今為止已發(fā)現(xiàn)有4個(gè)不同物種來(lái)源的RGD毒素蛋白家族，這4大家族分別來(lái)源于蛇毒、吸血?jiǎng)游锼?、蜱類及七鰓鰻唾液腺分泌物[2-9]。來(lái)源于七鰓鰻口腔腺的 Lj-RGD3蛋白是本課題組發(fā)現(xiàn)的世界上第 4大類 RGD毒素蛋白(GenBank Accession No. ACS71748.1)。前期實(shí)驗(yàn)證明，rLj-RGD3具有抗血管新生、抗腫瘤增殖及抗血小板聚集的功能，且這些功能皆以細(xì)胞表面表達(dá)的整合素為靶點(diǎn)，這說(shuō)明Lj-RGD3是一種典型的RGD毒素蛋白[2,10]。

一級(jí)結(jié)構(gòu)的分析與比對(duì)結(jié)果表明，Lj-RGD3除具有RGD毒素蛋白的RGD模體特征外，其在一級(jí)結(jié)構(gòu)上與富含組氨酸糖蛋白 (Histidine-rich glycoprotein，HRG) 有同源性。富含組氨酸糖蛋白為發(fā)現(xiàn)于脊椎動(dòng)物血液中的血漿糖蛋白，由肝臟合成并釋放入血。其具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的N1-結(jié)構(gòu)域、N2-結(jié)構(gòu)域、C末端-Domain及富含組氨酸結(jié)構(gòu)域。其中的富含組氨酸結(jié)構(gòu)域能同時(shí)與眾多配體結(jié)合而行使多種功能，比如：抗血管新生，可溶性免疫復(fù)合物抑制，加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的清除，抗菌等生物學(xué)活性[11]。

鑒于 HRG也具有抗血管新生活性，本文對(duì)Lj-RGD3進(jìn)行了3個(gè)RGD模體的全缺失突變 (命名為L(zhǎng)j-112)，對(duì)作為RGD毒素肽的野生型Lj-RGD3與作為類HRG的突變體Lj-112的抗血管新生活性進(jìn)行了比較，以確定Lj-RGD3結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

野生型成體七鰓鰻Lampetra japonica采自于中國(guó)黑龍江流域。

ECV304 (人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞) 細(xì)胞購(gòu)自武漢大學(xué)；pET23b空質(zhì)粒及pET23b-RGD3重組質(zhì)粒為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒提取試劑盒、IPTG購(gòu)自購(gòu)自寶生物大連公司；組氨酸親和層析柱 (His·Bind Column)購(gòu)自Novagen公司；胎牛血清購(gòu)自德國(guó)PAA公司；堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 (Basicfibroblast growth factor，bFGF) 購(gòu)自PEPROTECH INC；四甲基偶氮咪唑 (MTT)、細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天公司；ELISA試劑盒和Matrigel均購(gòu)自美國(guó)BD公司；96孔板、Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自 Corning Costar公司；6日齡雞胚購(gòu)自大連韓偉養(yǎng)雞場(chǎng)。

1.2 生物信息學(xué)分析

采用 ExPASy系統(tǒng)軟件對(duì)蛋白的氨基酸組成和等電點(diǎn)進(jìn)行分析，采用UniProt blastp檢索程序?qū)Φ鞍走M(jìn)行序列比對(duì)。

1.3 目的基因的合成

野生型Lj-RGD3基因含有大量重復(fù)序列，無(wú)法進(jìn)行基因的定點(diǎn)突變，故采用全基因序列合成方法。Lj-RGD3 3個(gè)RGD模體的全缺失突變基因由大連寶生物公司合成，合成后基因以NdeⅠ和HindⅢ為酶切位點(diǎn)構(gòu)建至pET23b載體。

1.4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

提取突變體陽(yáng)性克隆質(zhì)粒 pET23b-112，CaCl2法[12]轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌大腸桿菌 Escherichia coli BL21中。

1.5 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化鑒定

對(duì)轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性菌進(jìn)行 30 ℃過(guò)夜的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體經(jīng)超聲破碎及離心后，提取上清，采用 Novagen公司的組氨酸親和層析柱對(duì)其進(jìn)行純化，以含甘油的Tricine-SDS-PAGE[13]電泳法進(jìn)行蛋白質(zhì)純度鑒定。

1.6 rLj-RGD3野生型與突變體蛋白rLj-112之間部分生物學(xué)活性的比較

1.6.1 MTT法檢測(cè)蛋白對(duì)細(xì)胞增殖的影響

將ECV304細(xì)胞接種于96孔板中，加入終濃度為30 pg/L的bFGF誘導(dǎo)細(xì)胞增殖24 h后，加入不同濃度的野生型Lj-RGD3與突變體Lj-112蛋白繼續(xù)培養(yǎng)24 h，MTT法測(cè)定波長(zhǎng)為490 nm下的光吸收值。

1.6.2 雞絨毛尿囊膜 (CAM) 實(shí)驗(yàn)

采用6日齡雞胚，bFGF誘導(dǎo)24 h后，以30 μL濃度為0.2 g/L的野生型rLj-RGD3、突變體rLj-112蛋白作用于雞胚，同時(shí)以 30 μL的七鰓鰻rLj-GRIM19 (0.2 g/L)、PBS、洗脫液為陰性對(duì)照，24 h后觀察血管的生長(zhǎng)情況。

1.6.3 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

采用Corning Costar公司的Transwell (8.0 μm pore size，polycarbonate filter，多聚碳酸鹽膜) 細(xì)胞培養(yǎng)板來(lái)比較以 bFGF為趨化劑，各蛋白及對(duì)照組試劑對(duì)上室內(nèi)ECV304細(xì)胞向下室遷移的影響。對(duì)遷移到Transwell下表面的細(xì)胞以O(shè)lympus顯微鏡觀察，每個(gè)樣片隨機(jī)選取4個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)(計(jì)數(shù)軟件為Dotcounter)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)統(tǒng)計(jì)。

1.6.4 細(xì)胞浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)

將人工基質(zhì)膜Matrigel鋪在Transwell的膜上，利用 Matrigel和 Transwell模仿體內(nèi)環(huán)境，同樣以bFGF為趨化劑來(lái)檢測(cè)兩種蛋白對(duì)ECV304細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。其余操作與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.6.5 酶聯(lián)免疫分析 (ELISA) 法檢測(cè)兩種蛋白對(duì)整合素連接激酶ILK-1表達(dá)的影響

在 ECV304細(xì)胞中加入終濃度為30 pg/L的bFGF誘導(dǎo)24 h后，加入同等劑量的野生型rLj-RGD3及突變體 rLj-112，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h，裂解細(xì)胞，10 000×g離心3 min，取上清。按照試劑盒說(shuō)明書采用ELISA法檢測(cè)蛋白對(duì)ILK-1表達(dá)的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件采用方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 野生型Lj-RGD3的序列比對(duì)及突變體Lj-112的cDNA序列合成

Lj-RGD3由118個(gè)氨基酸組成[10]，其一級(jí)結(jié)構(gòu)含有 17個(gè)組氨酸、17個(gè)精氨酸和 20個(gè)蘇氨酸，ExPASy軟件預(yù)測(cè)理論等電點(diǎn)為 10.01，屬堿性蛋白。運(yùn)用UniProt blastp程序?qū)σ吧蚅j-RGD3進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果表明，Lj-RGD3與馬來(lái)絲蟲Brugia malayi的富含組氨酸糖蛋白HRG有40%序列一致性，與馬來(lái)絲蟲的TCRβ具有45%的序列一致性 (圖1)。

由于HRG蛋白具有抗血管新生作用，本文對(duì)3個(gè)RGD模體全缺失后的Lj-RGD3基因進(jìn)行了序列合成 (由于含有大量重復(fù)序列，無(wú)法直接做定點(diǎn)突變)，合成序列克隆至pET23b載體 (圖2~3)。突變體命名為L(zhǎng)j-112。

2.2 基因重組蛋白rLj-RGD3、rLj-112的 IPTG誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定

Tricine的SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，親和層析后獲得了可溶性的rLj-RGD3和rLj-112純化蛋白，二者純度都在95%以上，分子量為15 kDa左右，這為進(jìn)一步的生物學(xué)活性研究奠定了基礎(chǔ)。由于rLj-RGD3和rLj-112都為堿性蛋白質(zhì)，故其電泳行為受所帶電荷影響而比預(yù)期位置滯后 (圖4)。

圖1 Lj-RGD3的UniProt blastp序列比對(duì)結(jié)果Fig. 1 Results of Lj-RGD3 NCBI blasting. HRGP: Histidine-rich glycoprotein, Brugia malayi (nematode worm); TCR β: T-cell receptor beta chain ANA 11, Brugia malayi (nematode worm). Identical residues are highlighted in grey.

圖2 野生型Lj-RGD3的cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 cDNA and deduced amino acid sequence of Lj-RGD3.

圖3 突變體Lj-112的cDNA及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 3 cDNA and deduced amino acid sequence of Lj-112.

圖4 Tricine SDS-PAGE分析經(jīng)親和層析純化的均質(zhì)蛋白Fig. 4 Tricine SDS-PAGE of the homogeneous protein purified by affinity chromatography. 1: mutation protein Lj-112; 2: Lj-RGD3 toxin protein; 3: SpectraTM multicolor low range protein ladder.

2.3 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112抗血管新生活性比較

2.3.1 對(duì)bFGF誘導(dǎo)的ECV304細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果顯示，野生型rLj-RGD3與突變體蛋白rLj-112對(duì)bFGF誘導(dǎo)的ECV304的細(xì)胞增殖都呈劑量依賴性抑制，rLj-RGD3的半劑量效應(yīng) (Median infective dose，IC50) 為0.889 μmol/L，突變體rLj-112的IC50為0.160 μmol/L。結(jié)果表明，rLj-112對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞 ECV304增殖的抑制強(qiáng)度約為野生型rLj-RGD3的6倍 (圖5)。

2.3.2 對(duì)bFGF誘導(dǎo)的雞絨毛尿囊膜 (CAM) 血管新生的抑制作用

腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移與血管生成有密切的關(guān)系，雞胚對(duì)抑制血管生成的藥物比較敏感，是研究血管新生和抗血管形成的最佳體內(nèi)模型之一。CAM血管新生實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入30 μL同等體積的PBS、七鰓鰻rLj-GRIM19 (6 μg)、蛋白純化洗脫液的對(duì)照組血管新生旺盛，對(duì)血管新生無(wú)抑制作用；而加入30 μL (6 μg) 同等劑量的rLj-RGD3和rLj-112組的CAM 血管新生都遭到破壞，且突變體蛋白 rLj-112對(duì)CAM血管新生的抑制作用強(qiáng)于野生型rLj-RGD3 (圖6)。

2.3.3 ECV304細(xì)胞的遷移實(shí)驗(yàn)

圖5 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112對(duì)ECV304細(xì)胞增殖的抑制作用Fig. 5 Inhibition on ECV304 cells proliferation by rLj-RGD3 and rLj-112.

圖6 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112對(duì)血管新生的抑制作用Fig. 6 rLj-RGD3 and rLj-112 to inhibit bFGF-induced angiogenesis in chick CAM assays. A window was opened on the egg shell and a methylcellulose disc containing 200 ng bFGF was implanted on CAMs of 6-days-old chick embryos. After 24 h of bFGF induction, 30 μL of PBS (A), 30 μL (6 μg) of rLj-GRIM19 (B), 30 μL of elution buffer (C), 30 μL (6 μg) of rLj-112 (D), 30 μL (6 μg) of rLj-RGD3(E) was applied to the embryos. 24 h later, CAM tissues were photographed with digital camera. The circles show the position of methylcellulose disc and the arrows show the discontinuous vessels.

血管新生高度依賴于內(nèi)皮細(xì)胞的的遷移，以bFGF作為趨化劑，比較野生型rLj-RGD3及突變體蛋白rLj-112對(duì)ECV304細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，同等劑量 (16 μg) 的野生型rLj-RGD3和突變體蛋白 rLj-112均可抑制 ECV304細(xì)胞的遷移，其遷移抑制率分別為50%和63%，突變體rLj-112對(duì)ECV304細(xì)胞遷移的抑制作用強(qiáng)于野生型 rLj-RGD3。陰性對(duì)照組小牛血清白蛋白 BSA及蛋白純化洗脫液則對(duì) ECV304細(xì)胞的遷移無(wú)影響(圖7~8)。

2.3.4 ECV304細(xì)胞的浸潤(rùn)實(shí)驗(yàn)

浸潤(rùn)同樣是血管新生的一個(gè)重要步驟，血管內(nèi)皮細(xì)胞只有在穿透細(xì)胞外基質(zhì)的情況下，才得以出芽的方式形成新的血管。利用人工基質(zhì)膜 matrigel和Transwell模仿體內(nèi)環(huán)境，可以有效地研究細(xì)胞的浸潤(rùn)行為。結(jié)果顯示，PBS、BSA及洗脫緩沖液對(duì)照組對(duì)ECV304細(xì)胞的浸潤(rùn)無(wú)抑制作用，而野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112后均可抑制ECV304細(xì)胞的浸潤(rùn)，且rLj-112的作用較強(qiáng) (圖9~10)。

2.3.5 ELISA法測(cè)定兩種蛋白對(duì)ILK-1表達(dá)的影響

與只加入PBS的對(duì)照組相比，rLj-RGD3野生型與突變體蛋白 rLj-112均可抑制 bFGF誘導(dǎo)的ECV304 ILK-1的表達(dá)，且效果隨抑制劑濃度增高而加強(qiáng)。相比之下，同劑量的rLj-112對(duì)ILK表達(dá)的抑制效果強(qiáng)于rLj-RGD3。BSA及蛋白純化洗脫液則對(duì)整合素連接激酶 (ILK-1) 表達(dá)無(wú)抑制作用(圖11)。

圖7 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112抑制ECV304細(xì)胞向bFGF遷移Fig. 7 Inhibitory effects of rLj-RGD3 and rLj-112 on ECV304 cells migration towards bFGF. **P<0.01 versus PBS alone, n=8.

圖8 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112對(duì)ECV304細(xì)胞向bFGF遷移的影響 (Olympus光學(xué)顯微鏡拍照，400×)Fig. 8 Inhibitory effects of rLj-RGD3 and rLj-112 on Ecv304 cells migration towards bFGF (Olympus light microscopy, 400×). ECV304 cells were treated with PBS (A), rLj-RGD3 (B) or rLj-112 (C) for 30 min, and then placed in the upper chamber of Transwell. bFGF (30 pg/L) was present as a chemoattractant which was added to the lower chamber. After 16 h incubation, cells were fixed in 4% paraformaldehyde. After removal of the nomigrated cells, the cells that migrated to the underside of filter membrane were photographed (400×) under Olympus light microscope.

圖9 野生型rLj-RGD3與突變體rLj-112抑制ECV304細(xì)胞的浸潤(rùn)Fig. 9 Inhibition of rLj-RGD3 and rLj-112 on ECV304 cells invasion through Matrigel. **P<0.01 versus PBS alone, n=8.

圖10 野生型rLj-RGD3與突變體蛋白rLj-112對(duì)ECV304細(xì)胞浸潤(rùn)行為的影響 (Olympus光學(xué)顯微鏡拍照，400×)Fig. 10 Inhibitory effects of rLj-RGD3 and rLj-112 on ECV304 cells invasion through Matrigel (Olympus light microscopy, 400×). ECV304 cells were treated with PBS (A), rLj-RGD3 (B) or rLj-112 (C) for 30 min, and then placed in the upper chamber of containing filer membrane which has been coated with Matrigel. bFGF (30 pg/L) was present as a chemoattractant which was added to the lower chamber. After 16 h incubation, cells were fixed in 4% paraformaldehyde. After removal of the nomigrated cells, the cells that migrated to the underside of filter membrane were photographed (400×) under Olympus light microscope.

圖11 野生型 rLj-RGD3與突變體rLj-112對(duì)ECV304中整合素連接激酶ILK-1表達(dá)的影響Fig. 11 Effects of ILK-1 expression on ECV304 cells by rLj-RGD3 and rLj-112. The black one is at presence of PBS, 1.2 μg of rLj-RGD3 or rLj-112 with ECV304 cells; the light one is at presence of PBS, 4.4 μg of rLj-RGD3 or rLj-112 with ECV304 cells. * P<0.05 versus PBS alone, n=3.

3 討論

日本七鰓鰻成體營(yíng)寄生生活，為吸血?jiǎng)游?。其頭部鰓下肌中有一對(duì)口腔腺，能分泌大量蛋白質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，七鰓鰻口腔腺天然分泌蛋白混合物及160 kDa的BGSP-1具有纖維蛋白原水解活性，具抗凝功能[13-14]。此外，口腔腺分泌蛋白提取物還具有抑制神經(jīng)元細(xì)胞興奮性功能[14]。對(duì)于吸血?jiǎng)游锒裕拗鞯哪蛯?duì)被吸食的痛感是寄生生活的障礙，而上述研究結(jié)果解釋了七鰓鰻營(yíng)寄生生活習(xí)性的生理基礎(chǔ)。隨著七鰓鰻口腔腺 cDNA文庫(kù)的建立，本實(shí)驗(yàn)室又發(fā)現(xiàn)了一條具有抗血小板聚集功能的Lj-RGD3蛋白[2]，這說(shuō)明七鰓鰻抗凝血功能涉及不只一種蛋白。

日本七鰓鰻野生型Lj-RGD3是含有3個(gè)RGD模體的RGD毒素蛋白。迄今為止已發(fā)現(xiàn)有4個(gè)不同物種來(lái)源的RGD毒素蛋白家族，這4大家族分別來(lái)源于蛇毒、吸血?jiǎng)游锼?、蜱類及七鰓鰻唾液腺分泌物[2]。來(lái)源于蛇毒的 RGD毒素蛋白也叫去整合素，是被研究得最為透徹也是最大的一族，依蛇種來(lái)源不同種類可達(dá)數(shù)十種[9,15-17]；來(lái)源于水蛭唾液腺的RGD毒素蛋白到目前為止只發(fā)現(xiàn)2類：decorsin及ornatin[5-6]；來(lái)源于蜱類的RGD毒素蛋白也有2種：variabilin及 savignygrin[7-8]；來(lái)源于七鰓鰻口腔腺的 Lj-RGD3蛋白是本課題組發(fā)現(xiàn)的第4大類RGD毒素蛋白[2]。由Lj-RGD3一級(jí)結(jié)構(gòu)分析可以看出，來(lái)自于蛇毒這一物種的去整合素之間同源性較高 (60%以上)，而物種間的 RGD模體毒素除具有RGD模體和多對(duì)半胱氨酸的共性外，在一級(jí)結(jié)構(gòu)上沒(méi)有同源性[2]。

本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明，rLj-RGD3具有抗血管新生、抗腫瘤增殖及抗血小板聚集的功能，且這些功能皆以細(xì)胞表面表達(dá)的整合素為靶點(diǎn)，這說(shuō)明Lj-RGD3是一種典型的RGD毒素蛋白[2,10]。生物信息學(xué)分析表明，Lj-RGD3在一級(jí)結(jié)構(gòu)上除了與其他物種的RGD毒素肽一級(jí)序列有RGD模體的共性外，同樣與之沒(méi)有同源性。然而，運(yùn)用UniProt blastp進(jìn)行序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，Lj-RGD3因富含組氨酸而與馬來(lái)絲蟲Brugia malayi的富含組氨酸糖蛋白HRG有40%序列一致性，與馬來(lái)絲蟲的TCRβ具有45%的序列一致性。由于前期證實(shí)Lj-RGD3具抗血管新生功能，故本文測(cè)重于Lj-RGD3突變后的類HRG功能研究。有關(guān)其TCRβ的功能將另文報(bào)道。

富含組氨酸糖蛋白為發(fā)現(xiàn)于脊椎動(dòng)物血液中的血漿糖蛋白，由肝臟合成并釋放入血。其具有4個(gè)結(jié)構(gòu)域：N端的 2個(gè)半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cystatin) 結(jié)構(gòu)域、C末端結(jié)構(gòu)域及中心富含組氨酸結(jié)構(gòu)域。這其中的富含組氨酸結(jié)構(gòu)域可與眾多配體結(jié)合而行使多種功能，比如：抗血管新生、可溶性免疫復(fù)合物抑制、加強(qiáng)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的清除、抗菌等生物學(xué)活性。HRG配體包括Zn2+、原肌球蛋白、肝素和硫酸肝素、血纖維蛋白溶酶原、血纖維蛋白溶酶、纖維蛋白原、凝血酶感蛋白、IgG、FcgR及補(bǔ)體等。正是由于 HRG有如此眾多配體，致使HRG可以與相當(dāng)寬范圍的細(xì)胞結(jié)合，這包括：內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅血球、血小板、類單核細(xì)胞株及壞死細(xì)胞[11]。

富含組氨酸的糖蛋白 (HRG) 可以有效地抑制血管新生，Vanwilddemeersch等[18]研究表明，HRG是通過(guò)其蛋白水解后釋出來(lái)的His-rich結(jié)構(gòu)域行使其血管新生抑制劑功能的。而來(lái)源于His-rich結(jié)構(gòu)域的一個(gè)35個(gè)氨基酸殘基的合成肽HRGP330和一個(gè)26個(gè)氨基酸殘基的合成肽HRGP335在體內(nèi)與體外均具有血管新生抑制活性。HRGP330和HRGP335是通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的肝素/硫酸肝素結(jié)合而行使抗血管新生功能。Juarez等報(bào)道HRGP以His-rich結(jié)構(gòu)域依賴方式抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的管形成和增殖，HRGP335有抗內(nèi)皮細(xì)胞趨化的作用[19]。

Lj-RGD3一級(jí)結(jié)構(gòu)富含組氨酸殘基，與HRG有同源性。將野生型的RGD3的3個(gè)RGD全部突變形成的突變體Lj-112可以說(shuō)是一種類富含組氨酸糖蛋白。本文對(duì)RGD模體全缺失突變體Lj-112的抗血管新生活性進(jìn)行了研究。正常的RGD毒素蛋白進(jìn)行RGD模體缺失后，應(yīng)該失去抗血管新生活性，而本文得到的研究結(jié)果表明，含組氨酸的RGD全缺失突變體Lj-112的抗血管新生功能卻更加強(qiáng)大，其抑制ECV304細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)和CAM血管新生的功能均強(qiáng)于野生型Lj-RGD3，這表明Lj-112是以類HRG的形式行使的抗血管新生功能。盡管兩種蛋白對(duì)整合素連接激酶 ILK-1的表達(dá)均有下調(diào)作用，但可以推測(cè)Lj-RGD3與Lj-112是以不同機(jī)制行使功能的。本實(shí)驗(yàn)室前期工作表明Lj-RGD3是以整合素為作用靶點(diǎn)的；而由于已有研究證實(shí)HRG可通過(guò)結(jié)合肝素/硫酸肝素位點(diǎn)阻止bFGF的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而下調(diào)ILK的表達(dá)[20-21]，所以可以推測(cè)Lj-112有可能是以ECV304細(xì)胞表面的肝素/硫酸肝素為靶點(diǎn)，這有待于進(jìn)一步證實(shí)。本研究還表明，Lj-RGD3在 RGD模體存在的情況下，是優(yōu)先與Integrin結(jié)合的，其與HRG同源的特性在RGD模體存在的條件下，并未使野生型 Lj-RGD3抗血管新生功能得到協(xié)同增強(qiáng)。而七鰓鰻的Lj-RGD3則可能會(huì)通過(guò)mRNA剪切或蛋白翻譯后剪切去掉RGD模體后，以截然不同的方式行使功能，七鰓鰻cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中存在的大量HRG序列有可能是這種推測(cè)的證據(jù)，這還有待于進(jìn)一步研究。

血管生成在胚胎血管形成、傷口愈合和器官的再生中都起到關(guān)鍵的作用，而腫瘤的增長(zhǎng)和遷移依賴于血管新生，內(nèi)皮細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移可以調(diào)節(jié)腫瘤的增殖[22]。抑制腫瘤的血管新生是治療癌癥的重要手段。野生型Lj-RGD3與突變體蛋白Lj-112對(duì)血管新生均具有抑制作用，突變體蛋白Lj-112顯示出了比野生型Lj-RGD3更有效的抑制作用，而且二者的作用靶點(diǎn)并不一致，這為以Lj-RGD3為原型的抗腫瘤藥物研發(fā)提供了多種可能，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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