徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,王擁軍,施杞,周重建

胚胎干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究進(jìn)展

徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,王擁軍,施杞,周重建

胚胎干細(xì)胞移植具有為損傷的脊髓提供營養(yǎng),或分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞使脫髓鞘的神經(jīng)再髓鞘化,或分化成神經(jīng)元并與宿主神經(jīng)元建立突觸連接等作用,從而修復(fù)受損的神經(jīng)功能,在脊髓損傷的治療中具有良好的應(yīng)用前景。

胚胎干細(xì)胞;脊髓損傷;移植;再生;修復(fù);綜述

脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重創(chuàng)傷,多由車禍、墜落等造成脊柱脫位、骨折所致。脊髓損傷后,死亡的神經(jīng)元不能再生,受損部位膠質(zhì)瘢痕增生,新生的軸突不能通過瘢痕組織,以及損傷部位的慢性脫髓鞘等病理改變[1-2],導(dǎo)致?lián)p傷平面以下感覺和運(yùn)動(dòng)功能障礙。即使在成人大腦中存在神經(jīng)干細(xì)胞,但其對(duì)脊髓損傷的修復(fù)能力非常有限,因此脊髓損傷后僅靠機(jī)體自身的能力無法修復(fù)脊髓功能。隨著神經(jīng)病理生理及神經(jīng)發(fā)育學(xué)研究的不斷深入,細(xì)胞移植被廣泛地應(yīng)用于脊髓損傷的治療。移植的細(xì)胞具有替代損傷的神經(jīng)元、修復(fù)損傷的髓鞘、構(gòu)成新的神經(jīng)軸突連接,從而達(dá)到修復(fù)損傷脊髓的作用。目前研究的移植細(xì)胞種類有:胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞、嗅鞘細(xì)胞、施萬細(xì)胞等[3]。胚胎干細(xì)胞由于其具有無限增殖的能力;廣闊的分化潛能,可分化出無限的、可供選擇的特定細(xì)胞類型;同時(shí)也能進(jìn)行基因工程操作,被認(rèn)為是理想的種子細(xì)胞來源。近期研究結(jié)果表明,胚胎干細(xì)胞或經(jīng)體外誘導(dǎo)分化形成的神經(jīng)前體細(xì)胞移植到損傷的脊髓,可進(jìn)一步分化成神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,使失髓鞘的神經(jīng)再髓鞘化,從而促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù),提示胚胎干細(xì)胞在脊髓損傷的治療中具有良好的應(yīng)用前景。

1 胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性

胚胎干細(xì)胞是來源于哺乳動(dòng)物早期胚胎內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的一種二倍體細(xì)胞,具有長期的未分化增殖能力;在特定的條件下,能夠向內(nèi)、中、外3個(gè)胚層的組織和細(xì)胞分化[4-6]。1981年Evans和Kaufman首次從小鼠囊胚中分離、培養(yǎng)得到小鼠胚胎干細(xì)胞[7]。此后,人們又相繼采用不同的方法從牛、羊、貓、狗和大鼠等哺乳動(dòng)物中分離得到胚胎干細(xì)胞[8-12]。1998年,Thomson利用體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)成功地從人類的囊胚分離得到人胚胎干細(xì)胞,經(jīng)體外培養(yǎng)4～5個(gè)月后仍能保持未分化狀態(tài),從而建立了人的胚胎干細(xì)胞系[13]。這些成果給細(xì)胞移植治療、藥物發(fā)現(xiàn)及篩選等帶來深遠(yuǎn)的影響,為體外培養(yǎng)出更多可供移植選擇的細(xì)胞類型奠定了基礎(chǔ)。

胚胎干細(xì)胞的主要特性可概括為:①全能性:在體外可誘導(dǎo)產(chǎn)生出3個(gè)胚層的分化細(xì)胞;在體內(nèi)能廣泛參與宿主各組織器官的生長、發(fā)育,形成嵌合體,特別是生殖系嵌合體;②可修飾性:可在體外進(jìn)行遺傳修飾,經(jīng)過遺傳修飾的胚胎干細(xì)胞具有攜帶外源基因的特性,同時(shí)也能保持發(fā)育的全能性;③無限增殖性:胚胎干細(xì)胞可保持未分化狀態(tài)下的增殖,即使經(jīng)過長期培養(yǎng),仍然保持形成3胚層衍生物的能力[14]。正是由于上述特性,胚胎干細(xì)胞廣泛應(yīng)用在細(xì)胞發(fā)育研究、基因靶向研究、轉(zhuǎn)基因小鼠疾病模型的制備以及移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的實(shí)驗(yàn)研究。近年的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,胚胎干細(xì)胞移植能夠促進(jìn)損傷脊髓功能的恢復(fù),為中樞神經(jīng)損傷的治療帶來了新希望[15-25]。

2 胚胎干細(xì)胞在脊髓損傷再生修復(fù)中的應(yīng)用

脊髓損傷的主要問題在于上、下行傳導(dǎo)神經(jīng)纖維(軸突)束的斷裂,導(dǎo)致上、下神經(jīng)元之間形成的神經(jīng)通路中斷。胚胎干細(xì)胞移植具有為損傷的脊髓提供營養(yǎng),或分化成少突膠質(zhì)細(xì)胞使脫髓鞘的神經(jīng)再髓鞘化,或分化成神經(jīng)元并與宿主神經(jīng)元建立突觸連接等作用,從而修復(fù)受損的神經(jīng)功能。目前,利用胚胎干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的方法有:未分化的胚胎干細(xì)胞直接移植、經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞后移植、經(jīng)基因修飾后移植以及聯(lián)合支架或其他細(xì)胞共同移植等。

2.1 未分化的胚胎干細(xì)胞直接移植 Bottai等將未分化的胚胎干細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射移植治療T8脊髓損傷的小鼠,發(fā)現(xiàn)移植28 d后小鼠的運(yùn)動(dòng)功能明顯改善。移植胚胎干細(xì)胞主要是通過減少巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的侵入以保護(hù)腹側(cè)的髓鞘,而對(duì)幾種神經(jīng)營養(yǎng)因子和炎癥因子表達(dá)均無明顯影響。雖然在骶髓部位發(fā)現(xiàn)了來源于移植的胚胎干細(xì)胞的神經(jīng)細(xì)胞(這些細(xì)胞呈nestin和β-tubulin陽性)出現(xiàn)了不對(duì)稱的克隆,但沒有形成腫瘤[15]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,未分化的胚胎干細(xì)胞移植后可以通過減少炎性細(xì)胞侵入和保護(hù)髓鞘免受破壞,從而促進(jìn)損傷脊髓的修復(fù),提高神經(jīng)功能。

2.2 胚胎干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化為神經(jīng)前體細(xì)胞后移植 目前,采用將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)前體細(xì)胞后再移植治療脊髓損傷的報(bào)道相對(duì)較多,主要的考慮是將胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)后再移植可以降低腫瘤形成的危險(xiǎn)。Liu等采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)方法建立大鼠脫髓鞘模型,然后將來源于胚胎干細(xì)胞的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞移植到脊髓后索,檢測(cè)胚胎干細(xì)胞在脫髓鞘部位的存活、遷移、分化以及形成成熟髓鞘的情況,發(fā)現(xiàn)在脫髓鞘部位可以觀察到大量的移植細(xì)胞存活,并分化成成熟的少突膠質(zhì)細(xì)胞;將該少突前體細(xì)胞移植到先天性髓鞘缺失的成熟小鼠脊髓后,發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞不但可遷移且與宿主細(xì)胞整合,形成新的髓鞘盤旋圍繞宿主軸索[16]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,移植胚胎干細(xì)胞來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞可以替代損傷脊髓部位缺失的髓鞘。Mc-Donald等將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成的神經(jīng)前體細(xì)胞注射到大鼠脊髓壓迫部位,觀察到移植的細(xì)胞在損傷部位存活,分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元,并向受損脊髓的兩端遷移了8 mm[17-18]。該實(shí)驗(yàn)表明了移植外源性的少突膠質(zhì)細(xì)胞可促使中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后脫髓鞘的神經(jīng)纖維髓鞘再生,產(chǎn)生新的郎飛結(jié),使傳導(dǎo)通路部分或全部恢復(fù),對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的修復(fù)具有重要作用。Keirstead等將人胚胎干細(xì)胞來源的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞移植到成年大鼠脊髓損傷部位,發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞可以增加損傷脊髓再髓鞘化,提高運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù);并證明早期(損傷后7 d)進(jìn)行細(xì)胞移植具有修復(fù)脊髓功能作用,而晚期(損傷后10個(gè)月)則沒有修復(fù)作用[19]。亦有實(shí)驗(yàn)表明,將人的胚胎干細(xì)胞分化成少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,然后再移植到損傷的頸髓部位可促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)[20]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了胚胎干細(xì)胞來源的少突膠質(zhì)細(xì)胞能與宿主細(xì)胞整合,使脫髓鞘的神經(jīng)再髓鞘化,提示胚胎干細(xì)胞分化來的神經(jīng)前體細(xì)胞移植可能是一種有效地治療原發(fā)和繼發(fā)的成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病的方法[2,16,21]。

2.3 胚胎干細(xì)胞經(jīng)基因修飾后移植 單純的移植雖然對(duì)損傷的脊髓具有一定的修復(fù)作用,但仍達(dá)不到理想的結(jié)果。其主要原因是因?yàn)閾p傷的脊髓微環(huán)境不利于移植細(xì)胞存活和分化成有利于神經(jīng)修復(fù)的神經(jīng)細(xì)胞。因此,有學(xué)者嘗試通過基因修飾的方式來促進(jìn)移植細(xì)胞的存活和分化。如Chen等通過轉(zhuǎn)染細(xì)胞黏附因子L1后,再移植到損傷的脊髓,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的胚胎干細(xì)胞存活時(shí)間明顯多于未轉(zhuǎn)染的[22]。Hamada等將MASH1基因轉(zhuǎn)染到胚胎干細(xì)胞,促進(jìn)其在體外向神經(jīng)前體細(xì)胞分化,然后將神經(jīng)前體細(xì)胞移植到損傷的脊髓,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該方法有利于胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化和軸突的生長,從而改善運(yùn)動(dòng)功能[23]。這些結(jié)果表明了經(jīng)基因修飾后的胚胎干細(xì)胞更有利于移植治療脊髓損傷。

2.4 胚胎干細(xì)胞聯(lián)合支架或其他細(xì)胞移植 Hatami等將人的胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)前體細(xì)胞,聯(lián)合膠原支架移植治療脊髓損傷,結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植后大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)和感覺功能都得到了提高[24]。Salehi等通過胚胎干細(xì)胞聯(lián)合嗅鞘細(xì)胞移植,結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合移植在剩余脊髓組織百分率、神經(jīng)元的分化率以及后肢功能方面明顯優(yōu)于單純的胚胎干細(xì)胞或嗅鞘細(xì)胞移植[25]。表明了胚胎干細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞具有協(xié)同促進(jìn)脊髓修復(fù)的作用。這些實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了胚胎干細(xì)胞具有促進(jìn)脊髓功能的恢復(fù),而且聯(lián)合治療優(yōu)于單一的移植治療。

3 問題與展望

上述的結(jié)果均證明了胚胎干細(xì)胞早期移植治療脊髓損傷是有效的,而且經(jīng)基因修飾后的胚胎干細(xì)胞或者聯(lián)合其他細(xì)胞或支架移植的效果更好,但這距臨床應(yīng)用仍有一段距離,其主要的問題有:①胚胎干細(xì)胞的定向分化:目前,在體外可采用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成神經(jīng)細(xì)胞,但這些方案無法用到體內(nèi)誘導(dǎo);另外,在體內(nèi)由于受到脊髓損傷的病理環(huán)境影響,胚胎干細(xì)胞分化成神經(jīng)元的比率遠(yuǎn)小于體外培養(yǎng);②胚胎干細(xì)胞移植的安全性:雖然目前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)胚胎干細(xì)胞移植后形成腫瘤,但這些實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)間都比較短,而且在移植未分化的胚胎干細(xì)胞28 d后骶髓部位形成了不對(duì)稱的克隆,表明未分化的胚胎干細(xì)胞移植仍然存在成瘤的危險(xiǎn);③移植后胚胎干細(xì)胞的存活:損傷的脊髓存在炎癥反應(yīng)增高、免疫反應(yīng),這些病理反應(yīng)和機(jī)體的排斥反應(yīng)不利于移植細(xì)胞的存活。因此,需要進(jìn)一步研究的主要問題有以下幾方面:①胚胎干細(xì)胞或神經(jīng)前體細(xì)胞在損傷脊髓的病理環(huán)境下的分化規(guī)律,明確不同因子對(duì)移植細(xì)胞的分化和存活影響情況;②在評(píng)價(jià)胚胎干細(xì)胞移植有效性的同時(shí),需要對(duì)移植的細(xì)胞進(jìn)行長期的跟蹤觀察,分析移植細(xì)胞的成瘤情況;③探索新的治療方案,因?yàn)榧顾钃p傷后的病理改變復(fù)雜多樣,單一的治療手段僅能部分恢復(fù)脊髓的功能,而通過不同治療方案的聯(lián)合應(yīng)用可能能更好促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。

[1]Ronaghi M,Erceg S,Moreno-Manzano V,et al.Challenges of stem cell therapy for spinal cord injury:human embry onic stem cells,endogenous neural stem cells,or induced pluripotent stem cells?[J].Stem Cells,2009,28(1):93-99.

[2]Faulkner J,Keirstead HS.Human embry onic stem cell-derived oligodendrocy te progenitors for the treatment of spinal cord injury[J].T ranspl Immunol,2005,15(2):131-142.

[3]Bareyre FM.Neuronal repair and replacement in spinal cord injury[J].J Neurol Sci,2008,265(1-2):63-72.

[4]Sharma R,Greenhough S,Medine CN,et al.T hree-dimensional culture of human embryonic stem cell derived hepatic endoderm and its role in bioartificial liver construction[J].J Biomed Biotechnol,2010,236147[Epublish ahead].

[5]Boyd NL,Robbins KR,Dhara SK,et al.Human embryonic stem cell-derived mesoderm-like epithelium transitions to mesenchymal progenitor cells[J].Tissue Eng Part A,2009,15(8):1897-1907.

[6]Masaki H,Nishida T,Kitajima S,et al.Developmental pluripotency-associated 4(DPPA4)localized in active chromatin inhibits mouse embryonic stem cell differentiation into a primitive ectoderm lineage[J].J Biol Chem,2007,282(45):33034-33042.

[7]Evans MJ,Kaufman M H.Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos[J].Nature,1981,292(5819):154-156.

[8]Kubota C,Yamakuchi H,T odo roki J,et al.Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture[J].P roc Natl Acad Sci USA,2000,97(3):990-995.

[9]Campbell KH,McWhir J,Ritchie WA,et al.Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line[J].Nature,1996,380(6569):64-66.

[10]Shin T,Kraemer D,Pryor J,et al.A cat cloned by nuclear transplantation[J].Nature,2002,415(6874):859.

[11]Lee BC,Kim MK,Jang G,et al.Dogs cloned from adult somatic cells[J].Nature,2005,436(7051):641.

[12]Zhou Q,Renard JP,Le Friec G,et al.Generation of fertile cloned rats by regulating oocy te activation[J].Science,2003,302(5648):1179.

[13]Thomson JA,Itskovitz-Eldor J,Shapiro SS,et al.Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts[J].Science,1998,282(5391):1145-1147.

[14]Srivastava AS,Malhotra R,Sharp J,et al.Potentials of ES cell therapy in neurodegenerative diseases[J].Curr Pharm Des,2008,14(36):3873-3879.

[15]Bottai D,Cigognini D,M adaschi L,et al.Embryonic stem cells promote motor recovery and affect inflammatory cell infiltration in spinal cord injured mice[J].Exp Neurol,2010,223(2):452-463.

[16]Liu S,Qu Y,Stewart T J,et al.Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(11):6126-6131.

[17]M cDonald JW,Liu XZ,Qu Y,et al.Transplanted embry onic stem cells survive,differentiate and promote recovery in injured rat spinal cord[J].Nat Med,1999,5(12):1410-1412.

[18]M cDonald JW,Howard MJ.Repairing the damaged spinal cord:a summary of our early success with embryonic stem cell transplantation and remyelination[J].Prog Brain Res,2002,137:299-309.

[19]Keirstead HS,Nistor G,Bernal G,et al.Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyte progenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinal cord injury[J].J Neurosci,2005,25(19):4694-4705.

[20]Sharp J,Frame J,Siegenthaler M,et al.Human embryonic stem cell-derived olig odendrocyte progenitor cell transplants improve recovery after cervical spinal cord injury[J].Stem Cells,2009,28(1):152-163.

[21]Brustle O,Jones KN,Learish RD,et al.Embryonic stem cell-derived glial precursors:a source of myelinating transplants[J].Science,1999,285(5428):754-756.

[22]Chen J,Bernreuther C,Dihne M,et al.Cell adhesion molecule l1-transfected embryonic stem cells with enhanced survival support regrowth of corticospinal tract axons in mice after spinal cord injury[J].J Neurotrauma,2005,22(8):896-906.

[23]Hamada M,Yoshikawa H,Ueda Y,et al.Introduction of the MASH1 gene into mouse embryonic stem cells leads to differentiation of motoneuron precursors lacking Nogo receptor expression that can be applicable for transplantation to spinal cord injury[J].Neurobiol Dis,2006,22(3):509-522.

[24]Hatami M,Mehrjardi NZ,Kiani S,et al.Human embryonic stem cell-derived neural precursor transplants in collagen scaffolds promote recovery in injured rat spinal cord[J].Cytotherapy,2009,11(5):618-630.

[25]Salehi M,Pasbakhsh P,Soleimani M,et al.Repair of spinal cord injury by co-transplantation of embryonic stem cell-derived motor neuron and olfacto ry ensheathing cell[J].Iran Biomed J,2009,13(3):125-135.

Embryonic Stem Cell Transplantation for Spinal Cord Injury(review)

XU Le-qin,DINGDao-fang,LI Xiao-feng,etal.Institute of Spine,Longhua Hospital,ShanghaiUniversity of Chinese Traditional Medicine,Shanghai 200032,China

Transplantation of embryonic stem cells could promote nerve repair by providing nutrients to the injured spinal cord,or differentiating into remyelinating oligodendrocytes or neurons integrating with the host neurons,which has a bright future in the treatment of spinal cord injury.

embryonic stem cell;spinal cord injury;transplantation;regeneration;repair;review

[本文著錄格式]徐樂勤,丁道芳,李曉鋒,等.胚胎干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的研究進(jìn)展[J].中國康復(fù)理論與實(shí)踐,2011,17(1):51—53.

1.上海市教委創(chuàng)新基金(08-YZ56);2.國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30973760);3.上海市科委非政府國際合作項(xiàng)目(10410702800)。

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院,上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所,上海市 200032。作者簡介:徐樂勤(1981-),男,福建漳州市人,博士研究生,主要從事中醫(yī)藥促進(jìn)脊髓神經(jīng)損傷修復(fù)研究。通訊作者:周重建。

R651.2

A

1006-9771(2011)01-0051-03

2010-07-27

2010-11-26)

·社區(qū)康復(fù)·