豬胸膜肺炎放線桿菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展*

呂素芳,郭廣君,唐 娜,魏 鳳,沈志強(qiáng),2

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豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是引起豬傳染性胸膜肺炎(Porcine infectious pleuropneumonia)的致病菌,屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬。豬胸膜肺炎放線桿菌是一種革蘭氏陰性桿菌,具有很高的致病性,由本菌引起的豬接觸性傳染性胸膜肺炎是豬的呼吸道傳染病,各種年齡的豬均易感,本病在臨床上常見(jiàn),一旦發(fā)生感染則很難從豬場(chǎng)中根除。受感染的豬急性癥狀表現(xiàn)為具有高死亡率的纖維素性肺炎和胸膜炎,慢性癥狀表現(xiàn)為可造成動(dòng)物生長(zhǎng)緩慢的肺損傷,給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失,己成為嚴(yán)重危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一[1-2]。由于本病在急性期中有大量的鼻排泄物,所以有可能通過(guò)衣服、膠靴或儀器傳播,應(yīng)注意防護(hù)。對(duì)APP的病原學(xué)、血清型和流行特點(diǎn)的系統(tǒng)研究可以提高診斷和防控該病的水平。

1 血清型分類

APP的血清型較多,其血清型的劃分是依據(jù)莢膜多糖和菌體脂多糖的抗原性不同來(lái)區(qū)分的,目前己鑒定出15種血清型[3],由于各血清型間的抗原性和病原性不盡相同,導(dǎo)致不同血清型間沒(méi)有交叉保護(hù)力,從而增加了該病防治的難度。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要NAD,可將其分為生物I型和生物II型[4-5],其中APP 1～12型和15型是典型的生物Ⅰ型。其中血清Ⅰ型被分成2個(gè)亞型即1A和1B,血清5型被分成2個(gè)亞型即5A和5B。APP-13型和APP-14型為生物Ⅱ型,分布于歐洲及美國(guó)。我國(guó)流行的血清型為 1、2、3、5、7、10 等型 ,以 1、3 、7 型為主[6-7]。主要血清型間缺乏很好的交叉免疫性。由于APP的血清型眾多,各血清型間無(wú)交叉保護(hù)以及各地流行背景日益復(fù)雜致使該病難以控制,臨床上急需多價(jià)、高效的疫苗預(yù)防和控制該病,因此對(duì)APP的檢測(cè)和分型對(duì)防治至關(guān)重要。

2 毒力因子

胸膜肺炎放線桿菌的毒力因子有很多,其中主要包括溶血素(Apx)、莢膜多糖(Capsularpolysaccharide,CP)、脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、外膜蛋白(Outer membrane protein,OMP)、轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(T ransferrin binding protein,Tbp)、蛋白酶(Protease)、滲透因子(permeate factor,PF)、黏附素等[8-9]。這些毒力因子都能引起胸膜肺炎的發(fā)生,其中溶血毒素、莢膜多糖、脂多糖、外膜蛋白在胸膜肺炎發(fā)生過(guò)程中扮演著更為重要的角色,也是主要的免疫原性物質(zhì)。

2.1 溶血毒素(Actinobacillus pleuropneumoniae RTX-toxin,Apx) 毒素是APP主要的毒力因子,屬于RTX毒素(repeats in toxin)家族,在所有的15個(gè)App血清型中共分泌 4種 Apx毒素,分別為ApxⅠ 、ApxⅡ 、ApxⅢ和ApxⅣ。前3種Apx毒素既是App致病的主要毒力因子,又是App主要的保護(hù)性抗原[10],對(duì)于疾病臨床癥狀的出現(xiàn)以及典型的肺部病變是必需的。不溶血的突變株不能對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生保護(hù)力,不產(chǎn)毒素的菌株只能對(duì)其相應(yīng)血清型的感染產(chǎn)生保護(hù),而不能對(duì)其他血清型的感染產(chǎn)生保護(hù)。不同的血清型分泌不同的毒力因子,對(duì)宿主產(chǎn)生不同的致病性,因此毒力因子及其基因與血清型存在著密切的關(guān)系。

2.1.1 ApxI 相對(duì)分子質(zhì)量為105 ku,具有很強(qiáng)的溶血活性[11],對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用,血清型1,5,9,10,11和14均能表達(dá)并分泌。有活性的ApxI受一個(gè)操縱子的調(diào)控,包括4個(gè)基因,即ApxI CABD。ApxIA基因編碼毒素蛋白的前體,ApxIC基因編碼毒素翻譯后的激活物,ApxI BD基因的產(chǎn)物負(fù)責(zé)毒素的分泌。在血清型1,5a,5b,9,10和11中,存在完整的ApxI的操縱子,它們產(chǎn)生具有強(qiáng)溶血和強(qiáng)細(xì)胞毒性的ApxI。這幾種血清型也往往造成傳染性胸膜肺炎的急性爆發(fā)。此毒力基因在幾個(gè)血清型間均有交叉抗原性,可利用其高度的保守性對(duì)此類血清型APP進(jìn)行正確診斷,特別是APP 10型菌只分泌ApxI而不分泌其他毒素,因此可利用ApxI作為診斷抗原,全面確診該病有著重要的臨床意義。嚴(yán)克霞等[12]利用毒性極強(qiáng)的APP21菌株表達(dá)的ApxIA毒素,與天然毒素進(jìn)行免疫原性比較,結(jié)果復(fù)性的重組表達(dá)蛋白和天然毒素均具有較好的免疫原性,對(duì)小鼠產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)。馬艷芳[13]等研究毒素Apx l對(duì)小鼠的致病性及免疫原性,結(jié)果含ApxI的亞單位油乳劑疫苗抵抗異源血清型的APP攻擊時(shí)可以起到一定的保護(hù)作用。Liu等[14]在血清7型活疫苗株HB04C-基礎(chǔ)上,利用穿梭載體構(gòu)建共表達(dá)Apx-IA基因的免疫原性增強(qiáng)的多價(jià)弱毒APP疫苗株HB04C2,來(lái)預(yù)防豬的呼吸系統(tǒng)疾病。對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究,發(fā)現(xiàn)穿梭載體攜帶的ApxIA基因在疫苗株HB04C2里穩(wěn)定表達(dá),且不影響疫苗株的生長(zhǎng)能力。作為活疫苗對(duì)豬進(jìn)行氣管內(nèi)給藥,可以產(chǎn)生抵抗ApxIA和ApxIIA毒素的抗體,所有免疫豬均可以抵抗來(lái)自不同血清1型APP流行株的攻擊。結(jié)果表明,APP活疫苗株可以作為載體來(lái)表達(dá)不同的抗原。Zou H等[15]進(jìn)行了APP血清10型弱毒株apxIC-/P36+的構(gòu)建與分析研究,結(jié)果與親本株比較,體外培養(yǎng)的缺失株具有同樣的生長(zhǎng)效率且在老鼠體內(nèi)毒力減弱。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明,缺失apxIC基因的突變株能與親本株一樣成功誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。Chiang CH等[16]評(píng)價(jià)編碼ApxIA或ApxIIA基因的DNA疫苗在小鼠體內(nèi)的免疫反應(yīng)和保護(hù)效率。對(duì)小鼠肌肉注射疫苗后成功誘導(dǎo)了較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng),二價(jià)疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)Th1和Th2免疫反應(yīng)。利用APP血清1型進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn),結(jié)果,pcDNA-apxIA疫苗組和pcDNA-apxIA/pcDNA-apxIIA二價(jià)疫苗組的保護(hù)效率顯著高于陰性對(duì)照組,而pcDNA-apxIIA疫苗組只提供有效的保護(hù)效率,與對(duì)照組相比不明顯,證明二價(jià)疫苗為最佳。DNA疫苗作為第3代疫苗為APP免疫提供新思路。

2.1.2 ApxⅡ 相對(duì)分子質(zhì)量為105 ku,對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞也具有細(xì)胞毒性作用,因此它也被稱作clyⅡ(cytolysinⅡ)。ApxⅡ的操縱子與前者稍有不同,即ApxⅡCA操縱子和ApxⅠBD操縱子。除10和14型外,所有的血清型都可分泌此毒素。ApxⅡCA基因在所有的血清型中都非常保守,幾乎沒(méi)有變異。ApxⅡ毒素具有良好的免疫原性。王春來(lái)等[17]利用ApxⅡA基因構(gòu)建原核表達(dá)載體,結(jié)果在BL21中一包涵體形式表達(dá),經(jīng)Western blot檢測(cè),產(chǎn)物具有良好的免疫原性,可以作為抗原用于ELISA診斷。李任峰等[18]利用生物信息學(xué)方法對(duì)AY232288.1菌株(湖北分離株)的ApxllA基因及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和預(yù)測(cè),結(jié)果745-751和801-807氨基酸序列區(qū)段可能是B細(xì)胞表位優(yōu)勢(shì)區(qū),為 ApxllA基因功能的深入研究及APP多表位疫苗的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)。賈凡等[19]研制的ApxⅡ-ELISA試劑盒能夠有效的診斷豬傳染性胸膜肺炎。同時(shí)也可作為一種評(píng)價(jià)豬群免疫后免疫效果的有效方法。

2.1.3 ApxⅢ 沒(méi)有溶血活性,但其對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性作用。ApxⅢ操縱子具有完整的ApxⅢCABD基因,編碼120 ku的蛋白。其中ApxⅢA基因編碼毒素的結(jié)構(gòu)蛋白,ApxⅢBD基因具有高度同源性。ApxⅢ毒素存在于血清型2,3,4,6,8,15中,其中3型只能分泌ApxⅢ毒素,故毒力較弱。邵美麗等[20]以APP-2型參考株基因組為模板,擴(kuò)增出ApxⅢA基因3.1 kb的片段,構(gòu)建原核表達(dá)載體并獲表達(dá),Western blot證明融合蛋白具免疫學(xué)活性。

2.1.4 ApxⅣ 是近幾年才發(fā)現(xiàn)的一種毒素,相對(duì)分子質(zhì)量為202 ku。APP所有血清型在體內(nèi)均可分泌ApxⅣ,該毒素毒力很弱,只有在動(dòng)物體內(nèi)才會(huì)被誘導(dǎo)表達(dá),在任何培養(yǎng)基上均不表達(dá)。這是APP中迄今發(fā)現(xiàn)的惟一一個(gè)只在體內(nèi)表達(dá)的基因。ApxⅣ的種間特異性很強(qiáng),是APP中特異的毒素蛋白,不與其他親緣關(guān)系較近的種屬的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng),是良好的診斷試劑抗原[21]。國(guó)內(nèi),許多學(xué)者利用PCR技術(shù)擴(kuò)增ApxⅣ基因的片段或全序列,已取得比較滿意的效果。Dreyfus等[22]用ApxⅣ基因的原核表達(dá)蛋白,進(jìn)行免疫印記法檢測(cè)APP感染情況,結(jié)果靈敏度達(dá)100%,用該蛋白包被抗原制成ELISA試劑盒,可對(duì)感染后3 w的豬作出檢測(cè),同時(shí)可鑒別疫苗毒和野毒(differentiate infected from vaccinated animals,DIVA)。O'Neill C等[23]對(duì)英國(guó)地區(qū)APXIVA-DIVA方法進(jìn)行分析總結(jié)。Apx IVA毒素是區(qū)別APP自然感染毒和疫苗毒的首選抗原,將ISApl1插入apxIVA基因是常用的建立ApxIVA-DIVA的方法,但在apxIVA基因內(nèi)存在一個(gè)潛在的TGG到TGA的點(diǎn)突變。插入ISApl1后,除了兩個(gè)血清3型分離株外,同樣來(lái)自英國(guó)的其他血清2/3/6-8和12血清型均未發(fā)現(xiàn)突變,幾率為18.1%。Liu J等[24]在apxIIC-缺失突變株的基礎(chǔ)上獲得apxIVA突變株,通過(guò)在豬體內(nèi)感染試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)其毒力。記錄了豬體的臨床癥狀、肺臟損傷情況、血液的生化指標(biāo)和組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明,未缺失ApxIVA基因的APP菌株致病性更強(qiáng),揭示ApxIVA基因是APP完全毒力必須基因。Wang C等[25]研究了rApxIVN在豬抵抗APP感染中的免疫保護(hù)作用。以(rApxIVN)Ⅰ組、(rApxI+rApxII+rApxIII+rApxIVN+rOMP)Ⅱ組、(rApxI+rApxII+rApxIII+rOMP)Ⅲ組和 PBS組,分別免疫豬,用血清1型分離株JMS 06和血清2型分離株FX 01攻毒。結(jié)果Ⅰ組和Ⅱ組均產(chǎn)生了較高的針對(duì)rApxIVN的抗體滴度。針對(duì) rApxI,rApxII,rApxIII和rOMP的抗體滴度方面,Ⅱ組比Ⅲ組高。攻毒后,Ⅰ組免疫的豬表現(xiàn)了嚴(yán)重的呼吸癥狀和肺臟損傷,與對(duì)照組類似。Ⅱ組和Ⅲ組針對(duì)兩個(gè)血清型均能提供保護(hù),與Ⅲ組相比,Ⅱ組產(chǎn)生了輕微的肺損傷和發(fā)熱感染。結(jié)果表明,rApxIVN作為抗原可以提供針對(duì)APP攻擊的保護(hù)。Yang W等[26]建立了針對(duì)APP apxIVA基因的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù),對(duì)15株APP菌株和7株其他菌株進(jìn)行擴(kuò)增,與常規(guī)PCR比較,結(jié)果特異性相當(dāng),敏感性強(qiáng)10倍。臨床應(yīng)用顯示,通過(guò)細(xì)菌分離試驗(yàn)、巣式PCR和LAMP對(duì)比,65份采自健康豬的樣品結(jié)果均為陰性,115份采自有明顯呼吸癥狀豬的樣品結(jié)果,22份陽(yáng)性。與巢式PCR相比,LAMP表現(xiàn)出更高的敏感性,是一種檢測(cè)APP感染的可靠方法。

2.2 莢膜多糖(CPS) 莢膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要由重復(fù)單糖組成,莢膜多糖CPS結(jié)構(gòu)是 App在豬體內(nèi)合成和生長(zhǎng)的重要成分。莢膜多糖決定App的血清型抵抗力和毒素強(qiáng)度方面的重要性。不同菌種間莢膜的毒力及免疫原性的差別可能與莢膜成分和結(jié)構(gòu)有關(guān),莢膜所表現(xiàn)的毒力與宿主防御系統(tǒng)與莢膜本身之間的相互作用機(jī)制有很大的關(guān)系。通常莢膜的結(jié)構(gòu)、組成甚至厚度都可以影響到APP菌株的毒力[27]。一般來(lái)說(shuō),莢膜越厚毒性越強(qiáng)。Aloka B等[28]對(duì)莢膜多糖的3個(gè)開(kāi)放閱讀框cps1A,cps1B和cps1C進(jìn)行研究,通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得不同的缺失菌株,研究產(chǎn)生CP的能力。結(jié)果表明不同種類莢膜多糖可能通過(guò)表達(dá)機(jī)制來(lái)影響其毒力。

2.3 脂多糖(LPS) 脂多糖的毒力主要是脂質(zhì)A的作用。脂質(zhì)A可以激發(fā)機(jī)體防御系統(tǒng),最終導(dǎo)致組織損傷;另外,脂多糖還可增強(qiáng)溶血素對(duì)巨嗜細(xì)胞的毒性作用。相同的LPS的O-鏈表面抗原決定簇可以被多個(gè)不同的血清型同時(shí)擁有,如3、6、8型的O-鏈組成相似,1、9、11型的 O-鏈組成相似,4、7 型的O-鏈組成相似,這是血清型交叉反應(yīng)的主要原因。LPS免疫原性很弱,刺激產(chǎn)生的LPS抗體,只能抵抗發(fā)病,不能抵抗感染,且具有血清型的特異性,只能對(duì)APP的攻擊提供部分的保護(hù)。Tumamao等[29]的研究也表明這一點(diǎn)。

2.4 外膜蛋白(Omp) 具有免疫原性,其基因兩端保守,具有種特異性,中間易變異,5′端保守區(qū)域約200 bp,3′端約100 bp,中間變異區(qū)約700 bp。根據(jù)中間變異區(qū)將App生物Ⅰ型分為4個(gè)群,1、9、11、12型為一群 ,3、4、6、7 型為一群,5、10 型為一群,2、8型為一群。楊建德等[30]通過(guò)基因組文庫(kù)篩選獲得外膜蛋白基因,克隆表達(dá)該外膜蛋白。Western blot結(jié)果表明,該蛋白與APP康復(fù)期血清發(fā)生反應(yīng),為最終建立APPELISA檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。邵美麗等[31]以APP血清7型25-4株DNA為模板,擴(kuò)增OMP基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-omp,純化表達(dá)的蛋白,經(jīng)ELISA檢測(cè),該蛋白與兔抗APP的陽(yáng)性血清反應(yīng),具有很好的免疫活性。

2.5 轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(Transferrin Binding Proteins,Tbp) APP的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白有2種不同的蛋白構(gòu)成,即轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A(TbpA)和轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(TbpB),它們是功能性的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白受體,而且特異性的針對(duì)豬轉(zhuǎn)鐵蛋白。近年來(lái)的研究表明,TbpA和 TbpB是APP的主要毒力因子,Baltes等[32]用缺失tbpA和tbpS的血清7型突變株感染動(dòng)物,發(fā)現(xiàn)無(wú)任何臨床癥狀,不能引起機(jī)體的體液免疫反應(yīng),從感染的豬的扁桃體、肺、淋巴結(jié)及心臟中分離不到細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白也具有一定的保護(hù)性,用60 kD的 Tbp2免疫的豬只能對(duì)相同血清型菌株的攻擊可以提供部分保護(hù)。Overbeke等[33]發(fā)現(xiàn)當(dāng)用Top與Apx混合免疫時(shí),可以對(duì)血清9型提供100%的保護(hù),但仍不能完全抵抗肺部病變及細(xì)菌在體內(nèi)的定居。

3 研究展望

Apx毒素作為App最主要的毒力因子,同時(shí)也是最重要的保護(hù)性抗原,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生最大的保護(hù)力,且無(wú)須莢膜抗原的參與,對(duì)于不同血清型之間的交叉保護(hù)也起著重要的作用,是高效疫苗不可或缺的成分。在細(xì)菌滅活菌苗中加入細(xì)菌產(chǎn)生的Apx后,疫苗的保護(hù)力大為提高,主要成分為毒素的亞單位疫苗對(duì)動(dòng)物的保護(hù)力優(yōu)于缺少 Apx毒素的商業(yè)滅活苗。由于提取天然Apx的方法成本較高,產(chǎn)量低,不易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn),因而利用基因工程的方法,將毒素基因在廉價(jià)的原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá),易于大規(guī)模培養(yǎng),并降低了生產(chǎn)成本,且免疫原性和天然毒素沒(méi)有差異。在研制疫苗時(shí),對(duì)親本株的選擇上,要么是分離本地具強(qiáng)毒力的優(yōu)勢(shì)血清型,因其可以提供菌體以及毒素抗原,產(chǎn)生最大限度的保護(hù);要么使疫苗含有多種血清型,能夠盡可能地包括4種毒素,也就可以提供更全面的保護(hù)。

[1]杜愛(ài)慶,刁有祥,張偉,等.豬胸膜肺炎放線桿菌溶血毒素的克隆表達(dá)及其對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用[J].微生物學(xué)報(bào),2008,48(3)：342-348.

[2]Bossé JT,Janson H,Sheehan BJ,et al.Actinobacillus pleuropneumoniae：pathobiology and pathogenesis of infection[J].Microbes Infect,2002,4(2)：225-235.

[3]Blackall PJ,Klaasen HL,van den Bosch H,et al.Proposal of a new serovar ofActinobacillus pleuropneumoniae：serovar 15[J].Vet Microbiol,2002,84(1-2)：47-52.

[4]Boss JT,Maclnnes JI.Urease activity may contribute to the ability ofActinobacillus pleuropneumoniaeto establish infection[J].Can J Vet Res,2000,64(3)：145-150.

[5]Boss JT,Janson H,Sheehan BJ,et al.Actinobacillus pleuropneumoniae：pathobiology and pathogenesis of infection[J].Microbes Infect,2002,4(2)：225-235.

[6]陳小玲,楊旭夫,朱士盛.豬傳染性胸膜肺炎的流行現(xiàn)狀和防制措施[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2001,37：33-35.

[7]逮忠新,趙萍,邵英德,等.豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗的研究--菌種選擇、疫苗制備及安全性試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2002,32(3)：7-9.

[8]王春來(lái),楊旭夫,劉杰.胸膜肺料放線桿菌溶血毒素特性鑒定及免疫原性研究[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2001,23(3)：209-14.

[9]Maas A,M eens J,Baltes N,et al.Development of a DIVA subunit vaccine againstActinobaciIlus pleuropneumoniaeinfection[J].Vaccine,2006,24(49-50)：7226-7237.

[10]Jarma E,Regassa LB.Growth phase mediated regulation of theActinobacillus pleuropneumoniaeApxI and ApxII toxins[J].Microb Pathog,2004,36(4)：197-203.

[11]Boekema BK,Kamp EM,Smits MA,et al.Both ApxI and ApxⅡofActinobacillus pleuropneumoniaeserotype I are necessary for full virulence[J].Vet Microbiol,2004,100(1-2)：17-23.

[12]嚴(yán)克霞,劉建杰,周銳,等.重組豬胸膜肺炎放線桿菌毒素 ApxI對(duì)小鼠的急性毒性和免疫保護(hù)性研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2006,22(1)：65-70.

[13]馬艷芳,刁有祥,張?chǎng)?等.豬胸膜肺炎放線桿菌毒素Apx l對(duì)小鼠的致病性及免疫原性研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2009,25(03)：18-22.

[14]劉金林,陳硯,胡琳琳,等.表達(dá)ApxIA 的血清7型胸膜放線桿菌弱毒菌株的構(gòu)建及特性分析[J].生物工程學(xué)報(bào),2010,26(3)：305-310.

[15]鄒浩勇,陳楊,劉新軍,等.胸膜肺炎放線桿菌血清10型apxIC-/P36+弱毒株的構(gòu)建與鑒定[J].微生物學(xué)報(bào),2009,49(9)：1209-1216.

[16]Chiang CH,Huang WF,Huang LP,et al.Immunogenicity and protective efficacy of ApxIA and ApxIIA DNA vaccine againstActinobacillus pleuropneumoniaelethal challenge in murine model[J].Vaccine,2009,27(34)：4565-4570.

[17]王春來(lái),劉思國(guó),王牟平,等.胸膜肺炎放線桿菌 ApxⅡ毒素結(jié)構(gòu)基因的原核表達(dá)以及重組蛋白的免疫原性分析[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(1)：63-66.

[18]李任峰,田香勤,何啟蓋,等.豬胸膜肺炎放線桿菌ApxllA基因的序列分析及其B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)[J].生物技術(shù)通報(bào),2009,7：104-116.

[19]賈凡,王建銀,胡軍勇,等.豬胸膜肺炎放線桿菌ApxⅡ-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒的研制與應(yīng)用[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào),2009,29(3)：283-287.

[20]邵美麗,劉思國(guó),王春來(lái),等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌毒素ApxⅢA基因的克隆和表達(dá)[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2006,28(2)：139-141.

[21]Schaller A,Kuhn R,Kuhnert P,et al.Characterization of apxⅣA,a new RT X determinant ofActinbacillus pleuropneumoniae[J].Microbiology,1999,145(Pt 8)：2105-2116.

[22]Dreyfus A,Schaller A,Nivollet S,et al.Use of recombinant ApxIV in serodiagnosis ofActinobacillus pleuropneumoniaeinfections,development and prevalidation of the A pxIV ELISA[J].Vet Microbiol,2004,99(3-4)：227-238.

[23]O'Neill C,Jones SC,Bossé JT,et al.Population-based analysis ofActinobacillus pleuropneumoniaeApxIVA for use as a DIVA antigen[J].Vaccine,2010,28(31)：4871-4874.

[24]Liu J,Chen X,Tan C,et al.In vivo induced RTX toxin ApxIVA is essential for the full virulence ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].Vet Microbiol,2009,137(3-4)：282-289.

[25]Wang C,Wang Y,Shao M,et al.Positive role for rApxIVN in the immune protection of pig s against infection byActinobacillus pleuropneumoniae[J].Vaccine,2009,27(42)：5816-5821.

[26]Yang W,Pin C,Haibing G,et al.Loop-mediated isothermal amplification targeting the apxIVA gene for detection ofActinobacillus pleuropneumoniae[J].FEMS Microbiol Lett,2009,300(1)：83-89.

[27]Dubreuil JD,Jacques M,Mittal K R,et al.Actinobacillus pleuropneumoniaesurface polysaccharides：their role in diag nosis and immunogenicity[J].Anim Health Res Rev,2000,1(2)：73-93.

[28]Bandara AB,Law rence ML,Veit HP,et al.Association ofActinobacillus pleuropneumoniaecapsular polysaccharide with virulence in pig s[J].Infect Immun,2003,71(6)：3320-3328.

[29]Tumamao JQ,Bowles RE,van den BH,et al.Comparision of the efficacy of a subunit and a live streptomycin-dependent porcine pleuropneurnonia vaccine[J].Aust Vet J,2004,82(6)：370-374.

[30]楊建德,劉燕霏,李本強(qiáng),等.豬胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白基因(OMP一1)的克隆、表達(dá)及其ELISA方法的建立[J].天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,16(3)：1-4.

[31]邵美麗,劉思國(guó),王春來(lái),等.豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌外膜蛋白基因的克隆和表達(dá)[J].中國(guó)獸醫(yī)科學(xué),2006,36(1)：51-57.

[32]Baltes N,Hennig-Pauka I,Gerlach GF.Both transferring binding proteins are virulence factors inActinobacillus pleuropneumoniaeseroty pe 7 infection[J].FEMS Microbiol Lett,2002,209(2)：283-287.

[33]Van Overbeke I,Chiers K,Ducatelle R,et al.Effect of endobronchial challenge withActinobacillus pleuropneumoniaeserotype 9 of pig s vaccinated with a vaccine containing Apx toxins and transferrin-binding proteins[J].Vet Med B Infect Dis Vet Public Health,2001,48(1)：15-20.