劉英杰,潘艷艷,李 瑩,馮 輝,劉 軍,曹雅明

2.中國醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室,沈陽 110001

瘧疾流行主要由惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲感染所致,但兩個蟲種的毒力存在明顯差異,其中前者毒力較強,是導(dǎo)致重癥瘧疾發(fā)生的主要蟲種。瘧疾再感染的發(fā)生在流行區(qū)普遍存在,但惡性瘧再感染的發(fā)生風(fēng)險顯著高于間日瘧[1],表明原蟲毒力差異與再感染的免疫保護(hù)存在密切相關(guān)性。細(xì)胞免疫應(yīng)答是抵御胞內(nèi)寄生病原體再感染的主要因素[2],然而毒力不同的瘧原蟲感染早期根治性治療后,宿主在再感染過程中細(xì)胞免疫應(yīng)答是否存在差異,目前尚未見明確報道。

致死型約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii17XL,Py17XL)和非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodium yoelii17XNL,Py17XNL)分別與惡性瘧原蟲和間日瘧原蟲具有相似的生物學(xué)特性[3]。為此,我們對Py17XL和Py17XNL感染早期DBA/2小鼠進(jìn)行根治性治療,然后用同種瘧原蟲進(jìn)行再感染,通過對再感染前后細(xì)胞免疫應(yīng)答強度的檢測,探討了毒力不同瘧原蟲感染早期的根治性治療對再感染細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響。

1 材料與方法

1.1 小鼠、瘧原蟲和實驗感染 雌性,6～8 w齡DBA/2小鼠,分別經(jīng)腹腔接種1×106Py17XL和Py17XNL寄生的紅細(xì)胞。尾靜脈采血,吉姆薩薄血膜染色法計數(shù)紅細(xì)胞感染率。

1.2 藥物治療和小鼠再感染 初次感染后3 d,經(jīng)口給藥(氯喹90 mg/kg,青蒿琥脂片60 mg/kg),每天一次,連續(xù)3 d。待初次感染后90 d,小鼠用同種瘧原蟲再次攻擊感染。

1.3 脾細(xì)胞培養(yǎng) 無菌取出再感染前(0 d)和再感染后第1、3、5 d小鼠脾臟,常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液,調(diào)脾細(xì)胞終濃度為1×107/mL,于24孔培養(yǎng)板上加入細(xì)胞懸液,500 μ L/孔,一式 3 組 ,培養(yǎng) 48 h,收集上清,-80℃保存,待細(xì)胞因子檢測。

1.4 脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞百分率的檢測 在預(yù)先加入FcγⅢ/Ⅱ封閉抗體的染色管中加入脾細(xì)胞懸液0.1 mL,再加入抗CD4-FITC和抗CD69-PE mAb進(jìn)行表面染色,洗滌兩次并懸于500 μ L PBS中,流式細(xì)胞儀檢測。

1.5 細(xì)胞因子檢測 用ELISA試劑盒按說明書的實驗步驟對小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-10的含量進(jìn)行檢測,酶標(biāo)儀檢測450 nm處OD值。以試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算細(xì)胞因子含量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.5統(tǒng)計學(xué)分析軟件,Student′s-t檢驗比較各組均值的顯著性差異,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義(結(jié)果為3次結(jié)果的均值)。

2 結(jié) 果

2.1 再感染后不同時間的原蟲血癥水平 如圖1所示,兩組感染早期根治性治療小鼠在再感染過程中均出現(xiàn)了短暫的低水平蟲體血癥。在再感染后每一檢測時間點,不同毒力蟲株感染鼠的蟲體血癥水平基本相似,并均于攻擊后第6 d左右自愈;而未治療初次感染小鼠的蟲體血癥水平持續(xù)升高,表明毒力不同瘧原蟲初次感染早期根治性治療的小鼠對同種瘧原蟲的再感染具有相似的抵抗力。

圖1 Py17XL和Py17XNL初次感染和再感染后的蟲體血癥水平Fig.1 The levels of parasitemia after primary infection and reinfection with Py17XL and Py17XNL

2.2 再感染前后不同時間點脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞的百分率 如圖2所示,與正?；蛟俑腥厩靶∈笙啾?再感染后第1 d兩組小鼠脾T細(xì)胞中活化性T細(xì)胞百分率均明顯增加,表明再感染前小鼠體內(nèi)存在一定數(shù)量的記憶性T細(xì)胞,當(dāng)再次感染時這些細(xì)胞迅速活化。而此后其進(jìn)一步升高,則提示除記憶性T細(xì)胞活化外,可能又有一些初始T細(xì)胞逐漸活化。但在每一檢測時間點,不同毒力蟲株感染鼠活化性T細(xì)胞的百分率基本相似。

2.3 再感染前后不同時間點脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子水平 如圖3所示,與正?；蛟俑腥厩靶∈笙啾?再感染后第1 d兩組小鼠的IFN-γ水平均出現(xiàn)了有意義的升高,并于第3 d達(dá)到峰值水平;與此同時,TNF-α也開始顯著升高。在每一檢測時間點,不同毒力蟲株感染鼠間的IFN-γ和TNF-α水平?jīng)]有顯著差異。

2.4 再感染前后不同時間點脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th2型細(xì)胞因子水平 如圖4所示,與正?；蛟俑腥厩靶∈笙啾?兩組小鼠的IL-4和IL-10分別在再感染后第5 d和3 d出現(xiàn)了有意義的升高。盡管IL-10在再感染后第5 d出現(xiàn)一定程度的下降,但在每一檢測時間點,不同毒力蟲株感染鼠間的IL-4和IL-10水平并沒有顯著差異。

3 討 論

流行病學(xué)調(diào)查顯示,惡性瘧再感染的發(fā)生風(fēng)險高于間日瘧[1],盡管惡性瘧再感染后的蟲荷水平有所下降,但多數(shù)感染者仍具有較高的蟲荷水平,并有明顯的發(fā)熱等臨床表現(xiàn)[4],而間日瘧再感染后的蟲荷水平較低,且沒有明顯的臨床癥狀[5]。有研究證實,CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫在抵御瘧疾再感染過程中發(fā)揮重要作用[6],間日瘧感染者痊愈后一年左右,其外周血中淋巴細(xì)胞可對間日瘧原蟲抗原產(chǎn)生明顯的應(yīng)答反應(yīng)(分泌高水平IFN-γ),但惡性瘧感染者卻未能產(chǎn)生此應(yīng)答反應(yīng)[7]。這些結(jié)果充分提示,再感染的T細(xì)胞應(yīng)答水平與原蟲毒力差異存在密切相關(guān)性。

本實驗結(jié)果顯示,不同毒力蟲株感染鼠早期根治性治療后對同種瘧原蟲再感染具有相似的抵抗力;其再感染后均可迅速建立以IFN-γ分泌升高為主的高強度Th1應(yīng)答,而后又產(chǎn)生了適度的以IL-4和IL-10升高為主的Th2應(yīng)答,并且在每一相同檢測時間點,不同毒力蟲株感染鼠間無論是蟲體血癥水平還是活化性T百分率以及Th1和Th2細(xì)胞因子水平均未出現(xiàn)顯著差異。有研究證明,強毒株瘧原蟲感染可損傷或破壞宿主的免疫器官,進(jìn)而產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)[3];抗原劑量可改變宿主的免疫應(yīng)答類型和強度[8-9]。據(jù)此我們認(rèn)為,當(dāng) Py17XL和Py17XNL感染的紅細(xì)胞在外周血出現(xiàn)時即進(jìn)行根治性治療可使小鼠受到相同的蟲荷抗原刺激,同時也抑制了強毒株P(guān)y17XL對小鼠免疫系統(tǒng)的破壞作用,因此兩組小鼠在再感染時獲得了相似的免疫保護(hù)。

綜上所述,不同毒力瘧原蟲感染早期根治性治療后,宿主在同種瘧原蟲再感染時可產(chǎn)生模式和強度相似的細(xì)胞免疫應(yīng)答,強毒株原蟲感染也能獲得與弱毒株相同的可抵御再感染的能力。

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