羅毅

（沈陽市動物疫病預(yù)防控制中心，遼寧沈陽 110034）

魏氏梭菌是革蘭氏陽性大桿菌，屬條件性致病菌，廣泛分布于自然界，是腸道中的常在菌群之一。該菌能產(chǎn)生多種外毒素和酶類，其中，外毒素是主要的致病因子[1]。動物一旦感染，死亡率可達(dá)70%~100%。韓彗民等[2]認(rèn)為能夠造成家畜機(jī)體抵抗力下降的因素均能導(dǎo)致魏氏梭菌大量增殖、產(chǎn)生毒素進(jìn)而侵入血循環(huán)系統(tǒng)并導(dǎo)致發(fā)病。柴同杰等[3-4]提出同樣的觀點，即動物魏氏梭菌感染導(dǎo)致的猝死癥，主要由腸毒血癥造成機(jī)體主要器官的衰竭所致。

2010年11月沈陽市一奶牛小區(qū)奶牛發(fā)生猝死，死亡奶牛無任何前驅(qū)癥狀，突然發(fā)病死亡，以全身實質(zhì)臟器及消化道出血為特征，一周內(nèi)全群發(fā)病死亡。為查找病原，我們采集了有關(guān)病料進(jìn)行了病原分離、鑒定，并進(jìn)行了動物回歸試驗。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來源于沈陽市蘇家屯區(qū)一奶牛養(yǎng)殖小區(qū)死亡的奶牛，病料主要包括死亡牛的心、肝、脾、肺、腎、小腸等病變組織及腸內(nèi)容物。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；厭氧肉肝湯培養(yǎng)基、綿羊鮮血瓊脂平基均由本實驗室自行配制；VITEK-ANI厭氧菌鑒定卡購自梅里埃公司；革蘭氏染色液購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物 實驗用小白鼠購自沈陽醫(yī)學(xué)院。

1.1.4 主要儀器 VITEK全自動微生物分析系統(tǒng)（VITEK-32，法國梅里埃公司）、生物安全柜（NUAIRE NU-430-600E，美國NUAIRE公司）、高壓蒸汽滅菌器（TOMY SX-700，日本）、生化培養(yǎng)箱（SPX-100B-Z，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、生物顯微鏡（OLYMPUS-CX31，日本）、電子天平（METTLER-AE240，梅特勒-托利多上海儀器有限公司）、水浴箱（SALVIS-IC240，瑞士）、離心機(jī)（SIGMA-3K30，美國）。

1.2 方法

1.2.1 病原分離鑒定

1.2.1.1 形態(tài)觀察 無菌操作采取腸內(nèi)容物、黏膜刮下物、肝、脾做涂片革蘭氏染色，然后進(jìn)行顯微鏡檢查。

1.2.1.2 分離培養(yǎng) 將腸內(nèi)容物80℃，水浴15 min，然后2 000 rpm離心15 min，取上清液，一份接種麥康凱瓊脂平皿培養(yǎng)，另一份接入?yún)捬跞飧螠?，?7℃溫箱中培養(yǎng)20~24 h，然后在普通瓊脂平板和綿羊鮮血瓊脂平板上劃線，37℃溫箱進(jìn)行分離培養(yǎng)。同時將各臟器接種于肉肝湯，厭氧培養(yǎng)，再取培養(yǎng)物接種綿羊鮮血瓊脂平皿培養(yǎng)，挑單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)同時染色鏡檢。

1.2.1.3 生化試驗 將分離菌純培養(yǎng)物重新接種普通瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)20~24 h上卡，用VITEK-32進(jìn)行檢測。

1.2.2 動物試驗

1.2.2.1 腸毒素檢查 無菌操作取死牛病變明顯的腸內(nèi)容物，用滅菌生理鹽水進(jìn)行l(wèi):l稀釋后，4℃，3 000 rpm離心10 min，取上清液，再以4℃8 000 rpm離心15 min。然后取上清液腹腔注射16~20 g小白鼠5只，同時設(shè)立對照（注射滅菌生理鹽水）2只，l mL/只，72 h內(nèi)觀察結(jié)果。

1.2.2.2 分離菌毒力測定 分離菌接種厭氣肉肝湯中，取20 h的培養(yǎng)物腹腔注射小白鼠0.5 mL/只，注射5只，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 病原形態(tài)觀察

病死動物的肝臟和腸管內(nèi)容物革蘭氏染色鏡檢均見到一種革蘭氏染色呈陽性，有莢膜的粗大桿菌，單個或成雙排列。有的有芽孢，位于菌體偏端。純培養(yǎng)的細(xì)菌形態(tài)為革蘭氏陽性粗大桿菌，個別有芽孢。

2.2 培養(yǎng)特性

加溫處理后的腸內(nèi)容物在麥康凱瓊脂平皿上無細(xì)菌生長，而接入?yún)捬跞飧螠嚬?培養(yǎng)18 h后觀察，可見肉湯形成均勻的混懸液，液面上方靠近液體側(cè)試管壁上有2 cm長的石蠟附著。瓊脂平板培養(yǎng)菌落呈灰白色，表面光滑、濕潤、圓盤型，有的有放射狀條文的大菌落，血瓊脂板上有溶血環(huán)。

2.3 生化實驗

經(jīng)VITEK-32進(jìn)行檢測，結(jié)果99%為產(chǎn)氣莢膜桿菌。

2.4 動物實驗

2.4.1 腸毒素檢查結(jié)果 腸內(nèi)容物處理后注射5只小白鼠，24 h內(nèi)全部死亡，而對照組小白鼠全部存活，證明腸道內(nèi)容物中有毒素存在。

2.4.2 分離菌培養(yǎng)液的毒力測定 肝片肉湯培養(yǎng)物注射小白鼠，于72 h內(nèi)全部死亡。死后剖檢見小鼠喉頭、氣管環(huán)充血、出血；肺充血、氣腫；心尖端心肌表面有樹枝狀充血；肝臟出血；小腸腸壁松弛、腸粘膜變得薄而透明、漿膜有出血斑、盲腸粘膜有出血斑點、內(nèi)有稀糞并有氣泡；肝臟腫大、質(zhì)地脆易碎、呈土黃色；脾臟色深褐；腎臟淤血。

3 討論

近年來，我國魏氏梭菌感染動物致病的報道較多[5-9]，因其死亡率高給養(yǎng)殖戶帶來較大經(jīng)濟(jì)損失。由于魏氏梭菌病一般均是由細(xì)菌在腸道內(nèi)產(chǎn)生毒素引起發(fā)病，細(xì)菌本身并不一定侵入機(jī)體，因此臟器內(nèi)一般難于分離到此菌，而腸道內(nèi)菌群又較多，魏氏梭菌又是腸道內(nèi)的常在菌，故而分離較難，且即使是從腸道分離出此菌也很難區(qū)分是否是致病菌，必須結(jié)合臨床癥狀和動物實驗綜合來診斷。

魏氏梭菌正常存在于人和動物腸逍內(nèi)，并不致病，飼養(yǎng)條件突然改變，氣候驟變或擁擠狀態(tài)等原因?qū)е履c道細(xì)菌菌群紊亂，微生態(tài)平衡破壞，魏氏梭菌趁機(jī)劇烈地繁殖，瞬間在腸道產(chǎn)生了大量的外毒素，毒素粘附在腸粘膜上皮上，妨礙了氨基酸的吸收和運(yùn)輸，這時腸壁的通透性升高，使得毒素進(jìn)入血液循環(huán)，引起腸毒血癥，從而導(dǎo)致機(jī)體重要器官衰竭[3]。引起動物死亡，此病的發(fā)生來勢兇猛，傳播快，發(fā)病急劇，死亡迅速，往往來不及治療全群死亡，因此預(yù)防是防止該病發(fā)生的最好辦法。平時應(yīng)加強(qiáng)動物的飼養(yǎng)管理，減少動物的應(yīng)激反應(yīng)。

[1]Laetitia P，Maryse G，Michel R P.Clostridium perfringens：toxinotype and genotype[J].Trends in Microbiology，1999，7（3）：104-110.

[2]韓慧民，姚湘燕，孟銳奇.家畜猝死癥病因?qū)W研究[J].吉林畜牧獸醫(yī)，1996，18（4）：22-24.

[3]柴同杰，馬瑞華，常維山，等.產(chǎn)氣莢膜梭狀芽抱桿菌的流行與致病機(jī)制[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2001（1）：70-72.

[4]Chai Tongjie.Vorkommen von Iuftgetragenen Keimen in Tierstaellen and der Stallum gebung[M].Germany：Verlag Shaker，1999：55-56.

[5]周浮伍，李華章．A型魏氏梭菌所致家畜“猝死癥”的診斷與防制[J].畜牧與獸醫(yī)，1997，29（3）：262.

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[7]張玉果.羊A型魏氏梭菌病 [J].中國獸醫(yī)雜志，1998，24（1）：26．

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