田召芳，李春蕾，張文娟，陳 蕾，王偉濤

（1.煙臺(tái)市動(dòng)物疫病預(yù)防與控制中心，山東煙臺(tái) 264003；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

豬瘟是由豬瘟病毒引起的豬的傳染病，遍及世界各地，其特點(diǎn)是傳染性強(qiáng)，發(fā)病率極高，死亡率較高。發(fā)生過豬瘟疫情的規(guī)模場(chǎng)連續(xù)傳播的可能性極大，偶有耐過豬只則成為僵豬，失去飼養(yǎng)價(jià)值，嚴(yán)重威脅著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前，對(duì)于豬瘟的治療尚未找到有效的方法，用疫苗預(yù)防仍然是主要的防控手段。本文主要討論豬瘟疫苗的研究進(jìn)展、免疫失敗的原因及免疫程序。

1 豬瘟疫苗的研究進(jìn)展

1.1 傳統(tǒng)疫苗的研究

豬瘟兔化弱毒苗是目前世界上應(yīng)用最為廣泛的疫苗，包括組織苗（淋脾苗）和細(xì)胞苗。

我國(guó)1954年成功培育出豬瘟兔化弱毒株并制成疫苗（CLS），也叫“C株”或“K株”。疫苗病毒的復(fù)制主要在淋巴樣組織，特別是扁桃體，但有時(shí)能從腎臟檢查出苗毒抗原。該苗毒株不通過懷孕豬的胎盤屏障感染胎兒。豬瘟兔化弱毒株毒力不返強(qiáng)，在豬體內(nèi)連續(xù)傳代后仍保持原弱毒的特性。對(duì)乳豬和種豬無殘余毒性。接種各年齡的各品種豬，不產(chǎn)生豬瘟臨床癥狀，僅出現(xiàn)輕微病毒血癥，免疫后4~32 d內(nèi)，免疫豬不從尿中排毒，免疫豬與非免疫豬同圈飼養(yǎng)60 d，不發(fā)生接觸感染。檢查免疫豬臟器帶毒情況，證明免疫后7 d的豬體中脾及血尚存微量毒，17 d以后，免疫豬的血液、脾及骨髓中已均無病毒存在。免疫10~14日齡哺乳仔豬，不影響發(fā)育，注射懷孕1~3月齡母豬，不引起流產(chǎn)、死胎。

我國(guó)在1957年開始推廣豬瘟兔化弱毒組織苗，最初提倡就地制苗，就地使用。繼而真空冷凍干燥苗技術(shù)研制成功，凍干苗便于保存，成為我國(guó)防制豬瘟的有力工具。并開始采用家兔淋脾組織制苗。后又將豬瘟兔化弱毒接種牛，病毒可在牛體內(nèi)繁殖，淋脾毒價(jià)可達(dá)到乳兔水平，便于就地制苗或生產(chǎn)廠制凍干苗。1974年黑龍江獸醫(yī)研究所用原代豬腎細(xì)胞培養(yǎng)兔化弱毒制苗，獲得成功。1975年開始由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所組織全國(guó)獸醫(yī)藥品廠進(jìn)行病毒型疫苗轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)制苗的技術(shù)革新，將兔化弱毒接種原代腎細(xì)胞進(jìn)行工廠化制苗。為了避免用同源細(xì)胞生產(chǎn)疫苗有污染強(qiáng)毒的危險(xiǎn)，1980年研制成功綿羊腎細(xì)胞苗，1982年奶山羊腎細(xì)胞苗和1985年?duì)倥２G丸細(xì)胞苗研制成功，為豬瘟疫苗生產(chǎn)開辟了一條新的道路。羊腎和犢牛睪丸細(xì)胞苗接種豬后3 d可產(chǎn)生免疫力，5 d可產(chǎn)生堅(jiān)強(qiáng)的免疫力，免疫期一年。

除我國(guó)豬瘟兔化弱毒苗（C株）以外，日本的細(xì)胞弱毒苗（GPE-株）和法國(guó)的細(xì)胞弱毒苗（Thiverval株）也在一些國(guó)家使用。

1.2 豬瘟ST傳代細(xì)胞系疫苗

中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所等選擇了一種對(duì)豬等動(dòng)物安全、適宜于豬瘟病毒增殖的傳代細(xì)胞系，將ST細(xì)胞系感染裸鼠，觀察近100 d，沒有發(fā)現(xiàn)致瘤現(xiàn)象，也沒有觀察到組織病理變化，將該細(xì)胞連傳20多代，沒有染色體變化。證明細(xì)胞是安全的。豬瘟兔化弱毒病毒在該細(xì)胞中能實(shí)現(xiàn)高滴度增殖，通常情況下，每毫升細(xì)胞疫苗毒液的毒價(jià)能穩(wěn)定在50到100萬個(gè)兔體感染量，如果采用生物反應(yīng)器，則可達(dá)到300萬倍左右，是原代牛睪丸細(xì)胞豬瘟疫苗毒價(jià)的10~50倍。由于豬瘟兔化弱毒良好的安全性，高病毒含量的傳代疫苗對(duì)豬安全。免疫效力檢驗(yàn)結(jié)果顯示，將該疫苗做5 000倍稀釋免疫豬，仍能100%抵抗強(qiáng)毒的攻擊。高出牛睪丸原代細(xì)胞生產(chǎn)的疫苗近20倍。實(shí)驗(yàn)室免疫接種一次免疫期可以達(dá)到一年以上。部分省市推廣應(yīng)用效果良好。

1.3 基因工程亞單位疫苗

Hulst等[1]將Brescia株E2基因置于PRV的gX基因信號(hào)肽之后，構(gòu)入桿狀病毒AcNPV多角體啟動(dòng)子p10調(diào)控序列之下，構(gòu)建了能表達(dá)E2蛋白的重組桿狀病毒BacE1±（即pAcAS3gXE1±TMR），并在昆蟲細(xì)胞sf21中成功表達(dá)。將BacE1-感染sf21細(xì)胞后表達(dá)純化的20μg E2蛋白免疫豬，能很快產(chǎn)生很高的抗體效價(jià)，且能完全抵抗100LD50的CSFV Brescia強(qiáng)毒株的攻擊，其誘導(dǎo)出的中和抗體效價(jià)（Neutralizing peroxidase-linked antibody，NPLA）大于3 000，遠(yuǎn)高于CSFV弱毒疫苗C株誘導(dǎo)的NPLA（NPLA≥50即可使豬得免疫保護(hù)）。

Van Rijn等利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了兩種分別缺失了B/C抗原單位和A抗原單位的突變E2蛋白，其免疫豬后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，結(jié)果表明，E2蛋白上的一個(gè)結(jié)構(gòu)抗原單位誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)就能夠保護(hù)豬抵抗CSFV的攻擊。Van Rijn PA等將E2基因N端含A和BC抗原表位而不含TMR的部分構(gòu)入桿狀病毒，用其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫實(shí)驗(yàn)，證明無TMR的E2表達(dá)產(chǎn)物能保護(hù)同源病毒的攻擊，單一A或BC區(qū)也能保護(hù)。桿狀病毒表達(dá)體系表達(dá)E2，可望成為一個(gè)新的最為安全有效的亞單位疫苗。

1.4 病毒活載體疫苗

以無致病力或低毒力的痘苗病毒（VAC）和偽狂犬病毒（PRV）或腺病毒為載體，將豬瘟病毒E2基因與之重組研制出的基因重組疫苗，免疫動(dòng)物后可對(duì)二種病毒產(chǎn)生良好的保護(hù)力。

Hahn J等[2]將E2基因和偽狂犬病毒gX信號(hào)肽序列置于豬痘病毒P11啟動(dòng)子之下，構(gòu)建了表達(dá)E2的重組豬痘病毒（recombinant swinepox virus），該重組病毒表達(dá)的E2蛋白以二聚體的形式分泌到感染細(xì)胞的胞漿中。

Hooft等將CSFV E2基因插入PRV的糖蛋白gE基因位點(diǎn)，并分別置于不同啟動(dòng)子控制之下，比較了這些啟動(dòng)子對(duì)表達(dá)水平的影響，發(fā)現(xiàn)用人巨細(xì)胞病毒的立即早期基因啟動(dòng)子的效果最好，用它構(gòu)建的E2重組疫苗對(duì)豬的免疫效果最好。為了使研制的豬瘟病毒活載體更安全，最近Peeter等利用偽狂犬病毒囊膜糖蛋白gD具有病毒侵入宿主細(xì)胞所必需但并不為病毒在細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散所必需的特性。構(gòu)建了能表達(dá)豬瘟病毒E2蛋白的gD/gE雙缺失的偽狂犬病毒重組疫苗，免疫接種試驗(yàn)表明該活載體疫苗能使豬獲得對(duì)偽狂犬和豬瘟的雙重保護(hù)。因此目前國(guó)內(nèi)外在運(yùn)用PRV作為活病毒載體疫苗的研究比較活躍。

另外，還有人進(jìn)行了用腺病毒表達(dá)E2蛋白的嘗試。Hammond JM等[3]將CSFV Weybrdge株的E2基因插入進(jìn)PAV血清型3的基因組中，置于主要晚期啟動(dòng)子的調(diào)控之下，構(gòu)建了含E2基因的重組腺病毒rPAV-gp55，并用其進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，一次接種就能使豬得到良好的保護(hù)，皮下免疫可獲得100%的保護(hù)。且免疫攻毒豬無臨床癥狀，剖檢無病變。

1.5 DNA疫苗

DNA疫苗可以誘導(dǎo)體液免疫，又可誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，通過初步田間試驗(yàn)，已經(jīng)顯示了較好的免疫力。

Hammond JM等[4]在構(gòu)建含E2基因的重組腺病毒（rPAV-gp55）后，又構(gòu)建了一株含E2基因的裸質(zhì)粒DNA（naked plasmid DNA）疫苗，并用其作基礎(chǔ)免疫后再用rPAV-gp55作二次免疫，然后再用強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)效果比單用rPAV-gp55免疫好，單用rPAV-gp55后攻毒有輕微體溫反應(yīng)，而聯(lián)用無體溫反應(yīng)，脾、淋巴結(jié)剖檢無病變。余興龍、涂長(zhǎng)春等用pIRESlneo構(gòu)建了一株含E2基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDSW并用其制備了抗CSFV的單抗，并用豬瘟DNA疫苗成功保護(hù)了豬瘟強(qiáng)毒對(duì)豬的攻擊。但是，Markowska等用DNA疫苗免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)表明，強(qiáng)毒攻擊后體溫反應(yīng)有2天高于40℃，T、B淋巴細(xì)胞活性有輕微上升。盡管如此，以E2作為免疫基因構(gòu)建的CSFV DNA疫苗已顯示出了誘人的前景。

1.6 標(biāo)記疫苗的應(yīng)用研究

Moormann等[5]將CSFV C株gp55的N端序列用Brescia株相應(yīng)部分替代，構(gòu)建了一株雜交病毒株Flc-h6，用現(xiàn)有的抗E0和E2的單抗，可把Flc-h6與強(qiáng)毒Brescia及疫苗C株分開。用Flc-h6作為疫苗免疫豬，可以方便地將疫苗株與野毒感染豬分開。Dewulf J等做了亞單位標(biāo)記疫苗的保護(hù)試驗(yàn)，對(duì)照組有40%出現(xiàn)死亡并出現(xiàn)臨床癥狀，而免疫組能抵抗強(qiáng)毒攻擊。另外的研究又表明，E2亞單位標(biāo)記疫苗不能使豬獲得完全保護(hù)，不能完全抵抗病毒感染和排毒的研究結(jié)果。

更加完善的研究也正在進(jìn)行，Widjojoatmodio MN等構(gòu)建了Flc23（缺失E0中215位AA）和Flc22（缺失E0中66位AA）兩株重組病毒，能在SK6c26細(xì)胞上增殖，但不能產(chǎn)生感染性病毒，用其免疫豬后能產(chǎn)生抗E0的中和性抗體，抵抗Brescia強(qiáng)毒株的攻擊。后該組人員又用缺失E2基因中B/C區(qū)域（Flc4）或A區(qū)域（Flc48）的非傳播性標(biāo)記疫苗（non-transmissible marker vaccines）鼻內(nèi)接種進(jìn)行免疫，攻毒后可獲得全部或部分保護(hù)。

2 豬瘟免疫失敗的原因

2.1 母豬持續(xù)感染與垂直傳播

持續(xù)感染母豬經(jīng)胎盤垂直傳播HCV是給仔豬造成免疫失敗的一個(gè)重要因素[6]。這種持續(xù)感染的HCV可在母豬體內(nèi)維持750 d以上甚至終身存在，帶毒母豬產(chǎn)下的似乎健康的先天性感染仔豬可在長(zhǎng)達(dá)數(shù)月之久排出大量豬瘟病毒而不表現(xiàn)出癥狀，也檢測(cè)不出豬瘟抗體。帶毒母豬綜合征在妊娠母豬的感染率可達(dá)43%。妊娠母豬感染豬瘟病毒后，在整個(gè)妊娠期都可通過胎盤傳播。病毒是由血液通過胎盤屏障傳給胎兒的，傳播率達(dá)45%~86%。吃初乳和接種豬瘟疫苗不能阻止帶毒仔豬的死亡。免疫HCV不能使帶毒仔豬產(chǎn)生免疫保護(hù)力，即仔豬先天性免疫耐受，強(qiáng)毒攻擊可引起死亡。HCV垂直傳播的帶毒豬可發(fā)生水平傳播。HCV持續(xù)感染可引起母豬生殖系統(tǒng)病理變化導(dǎo)致繁殖障礙隨胎次增加而加強(qiáng)。

2.2 帶毒公豬的垂直傳播

用RT-PCR檢查帶毒公豬自然交配所產(chǎn)死胎的病毒基因型，結(jié)果表明[7]：死胎感染的病毒基因型與帶毒母豬原有的病毒基因型不同，而與帶毒公豬的病毒基因型相同。證明帶毒種豬不僅能通過母豬胎盤垂直傳播，而且能通過公豬精液垂直傳播，這是造成豬瘟持續(xù)感染的又一重要原因。

2.3 母源抗體的影響

當(dāng)母源抗體水平在1:16時(shí)，使用2個(gè)免疫劑量疫苗接種3頭豬，在強(qiáng)毒攻擊后，雖然這些豬均存活下來了，但3頭豬均有持續(xù)24~72 h的潛伏期，體溫升高1.5~2℃，持續(xù)2.5~8 d，而使用4個(gè)劑量免疫接種的3頭豬，僅1頭體溫升高2℃，持續(xù)時(shí)間僅為2.5 d。其他兩頭豬既無潛伏期，又無體溫升高。試驗(yàn)表明，提高疫苗中的病毒含量對(duì)母源抗體不整齊的豬場(chǎng)的豬瘟控制是非常必要的。

目前歐洲為了消滅豬瘟的亞臨床感染，多采用加大免疫劑量的方法。歐洲藥典規(guī)定用C株疫苗免疫時(shí)，肌肉注射劑量為100PD50（400RID）。我國(guó)豬瘟細(xì)胞苗出廠檢驗(yàn)以5萬倍稀釋能致兔體熱反應(yīng)為合格，即每mL原液含5萬個(gè)RID，規(guī)定的免疫劑量為150 RID（含37PD50），遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，況且我國(guó)豬場(chǎng)中存在的豬瘟持續(xù)感染問題和其他病原混合感染的問題比發(fā)達(dá)國(guó)家嚴(yán)重的多，使用常規(guī)免疫劑量預(yù)防接種，在母源抗體參差不齊和有豬瘟病毒持續(xù)感染的豬場(chǎng)，往往會(huì)造成免疫失敗。

2.4 非豬瘟病毒感染對(duì)豬瘟疫苗免疫效果的影響

利用20頭9月齡左右豬瘟、偽狂犬、豬繁殖與呼吸障礙綜合癥抗原、抗體陰性豬，將其分成6組，分別利用豬細(xì)小病毒（PPV）、豬偽狂犬病毒（PRV）和豬繁殖與呼吸障礙綜合癥病毒（PRRSV）單獨(dú)或混合感染，7 d后，連同對(duì)照豬4頭，免疫接種豬瘟兔化弱毒疫苗（HCLV），13 d后連同4頭陰性對(duì)照豬一起攻擊豬瘟石門強(qiáng)毒。整個(gè)試驗(yàn)期間分別每天測(cè)溫，觀察臨床癥狀，每周采集扁桃體和血樣做各種病毒抗原及抗體檢測(cè)。結(jié)果在攻擊石門強(qiáng)毒后2周，單獨(dú)和混合感染了非豬瘟病毒后接種HCLV疫苗的4個(gè)免疫組12頭豬除1頭外，11頭全為HCV抗原檢測(cè)陽性，且多呈強(qiáng)陽性；而單一HCLV疫苗免疫組在豬瘟強(qiáng)毒攻擊后檢測(cè)不到HCV；所有HCLV疫苗免疫豬均存活，而非免疫對(duì)照組4頭豬全部在攻毒16日內(nèi)死亡。試驗(yàn)表明非豬瘟病毒感染的確對(duì)豬瘟疫苗免疫效果有影響，能造成豬瘟疫苗免疫的失敗[8]。

2.5 疫苗質(zhì)量對(duì)免疫效果的影響

我國(guó)的豬瘟疫苗存在兩大問題，一是疫苗中病毒含量低。在脾淋組織疫苗方面，我國(guó)現(xiàn)有豬瘟兔脾淋組織疫苗工藝落后，制造疫苗所需的大耳白兔子數(shù)量太少，而且由于品種退化的原因，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了需要，同時(shí)效力檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)太低；在牛睪丸原代細(xì)胞疫苗方面存在的問題更大，我們現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)只有歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家的1/4，病毒含量太低，在其他疾病混合感染，母源抗體存在的情況下，很難達(dá)到應(yīng)有的免疫效果。除此之外，由于牛感染BVDV非常普遍，有牛睪丸原代細(xì)胞生成疫苗，不可避免的會(huì)遭到BVDV污染，污染了這種病毒，一是直接影響病毒在細(xì)胞中的增殖，同時(shí)還會(huì)造成BVDV疾病的傳播，直接影響胎兒存活。運(yùn)輸?shù)睦滏溝到y(tǒng)不完善導(dǎo)致豬瘟病毒存活力降低也是引起豬瘟免疫失敗的重要原因。

3 免疫接種程序

目前國(guó)內(nèi)還沒有統(tǒng)一的豬瘟免疫程序，各地養(yǎng)豬場(chǎng)的免疫程序大同小異，其基本情況大致有三種。

3.1 種豬集中統(tǒng)一免疫

種公豬、種母豬每年集中統(tǒng)一免疫兩次。仔豬21~25日齡左右首次免疫，50~60日齡左右加強(qiáng)免疫。

此程序必須經(jīng)常對(duì)仔豬的母源抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隨時(shí)調(diào)整仔豬的首免時(shí)間?？赏ㄟ^1~2年的監(jiān)測(cè)，找到本場(chǎng)仔豬的母源抗體消長(zhǎng)規(guī)律，從而確定時(shí)間。

3.2 斷奶時(shí)母豬與仔豬同時(shí)免疫

種公豬每年集中統(tǒng)一免疫兩次，種母豬斷奶后與其仔豬同時(shí)免疫，仔豬50~60日齡左右加強(qiáng)免疫一次。

采用這個(gè)程序時(shí)，最好也是先測(cè)定仔豬斷奶時(shí)的母源抗體效價(jià)，再確定免疫時(shí)間與母豬、仔豬的免疫劑量。仔豬母源抗體在1:32以上時(shí)，以4頭份疫苗劑量的免疫效果最佳。

3.3 超前免疫

種公豬、種母豬每年集中統(tǒng)一免疫兩次。仔豬吸吮初乳前進(jìn)行免疫，注射后1~2 h讓其自由吮奶[9]，30~40日齡時(shí)加強(qiáng)免疫一次。

由于超前免疫存在勞動(dòng)量大，難以實(shí)施等缺點(diǎn)，非疫區(qū)可不進(jìn)行超前免疫，但應(yīng)加強(qiáng)分娩豬舍的消毒，加強(qiáng)母豬的抗體檢測(cè)，確保母豬健康?？諔涯肛i的抗體水平不低于1:64，分娩母豬的抗體水平不低于1:32。對(duì)反復(fù)接種抗體水平仍然很低的母豬及帶毒母豬應(yīng)徹底淘汰。

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