大腸桿菌O157:H7金標(biāo)檢測試劑盒的研制

李小萍 杜惠芬 李克生 周海飛 鄭 悅 張遠(yuǎn)興 (蘭州雅華生物技術(shù)有限公司，蘭州730050)

大腸桿菌O157:H7是一種重要的人獸共患病原微生物，人感染O157:H7可患腹瀉、出血性結(jié)腸炎、溶血性尿毒綜合征及血栓性血小板減少性紫癜等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡[1]。O157:H7的感染，因其具有暴發(fā)流行趨勢、強(qiáng)烈的致病性與致死性，以及抗生素治療可能會加劇病情等特點(diǎn)，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，世界衛(wèi)生組織已將O157:H7列為新的食源性病原菌[2，3]。食源性感染以及與帶菌動物接觸是人感染O157:H7的主要途徑，反芻動物是O157:H7的主要宿主，陽性率0.1% ～16%。此外，從鵝、雞、馬、海鷗、鴿子、鴨、兔、狗、貓的糞便中也可分離到 O157:H7[4，5]。鼠與食品生產(chǎn)和人類生活關(guān)系密切，在疫病傳播中起重要作用，對食品安全和人類健康威脅極大，但至今缺乏有關(guān)鼠感染O157:H7的狀況及其流行病學(xué)意義的研究資料。食源性病原微生物是當(dāng)今世界上不斷增多的食品安全和突發(fā)性公共衛(wèi)生事件的主要誘因[6]。

目前，國內(nèi)外已報道大腸桿菌O157:H7的檢測方法包括:多重PCR、基因芯片、噬菌體分型、脈沖場凝膠電泳分析、生物傳感器以及乳膠凝集試驗(yàn)等，這些方法在檢測方面各有特點(diǎn)，但對儀器設(shè)備、操作人員要求較高，因此使用范圍有很大的局限性[7]。分離培養(yǎng)鑒定仍是檢測O157:H7的金標(biāo)準(zhǔn)，但其通常需要數(shù)天才能得到結(jié)果，不能滿足快速診斷的要求。

免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)檢測方法，它既有免疫學(xué)方法的特異性，又有簡便快速、不需儀器的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)、動植物檢疫、食品安全監(jiān)督等多領(lǐng)域已得到了廣泛應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)旨在運(yùn)用大腸桿菌O157:H7lps特異單克隆抗體(mAb)建立“雙抗體夾心法”大腸桿菌O157:H7膠體金免疫層析檢測方法，為臨床快速診斷以及檢驗(yàn)提供一種快速的檢測試劑盒。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸桿菌O157:H7lps單抗(CCTCCAB 200051)，由本實(shí)驗(yàn)室提供;其他菌株由珠海入境檢疫檢驗(yàn)局菌株中心食品檢測室提供，本實(shí)驗(yàn)室保存;羊抗鼠IgG單抗，購自北京利科聯(lián)合生物科技發(fā)展中心;牛血清白蛋白，天津血液病研究所產(chǎn)品;氯金酸，上海試劑廠;硝酸纖維素膜NC，sartorius stedim公司產(chǎn)品;無紡布、塑料板、單面膠帶、雙面膠帶、箭頭膠帶、粗纖維吸水紙，塑料卡盒國內(nèi)專業(yè)公司產(chǎn)品。

1.2 大腸桿菌 O157:H7單抗-膠體金復(fù)合物制備 取氯金酸(HAuCl4)用超純水溶解，配制0.01%的氯金酸水溶液，煮沸后按1.5 ml/100 ml加入1%檸檬酸三鈉水溶液;繼續(xù)煮沸10～20分鐘，待冷卻后用0.2 mol/L K2CO3調(diào)pH至8.2，快速攪拌并按4 mg/100 ml加入純化O157:H7單抗(7G2)，繼續(xù)攪拌15分鐘，按牛血清白蛋白240 mg/100 ml加入牛血清白蛋白，繼續(xù)攪拌5分鐘，最后加入10%氯化鈉水溶液使氯化鈉濃度為1%;2 000 r/min離心10分鐘，棄沉淀，上清10 000 r/min離心60分鐘，小心吸去上清，沉淀物按 8 mg/100 ml比例溶于0.02 mol/L，pH7.4 Tris-HCl緩沖液(含0.25%的牛血清白蛋白和0.02%NaN3)，即為膠體金-大腸桿菌O157:H7McAb結(jié)合物。將膠體金大腸桿菌O157 McAb結(jié)合物浸入無紡布，37℃干燥備用。

1.3 反應(yīng)膜的制備 取純化的大腸桿菌O157:H7單抗(7F9)和羊抗鼠 IgG抗體溶于0.01 mol/L pH7.4的PBS中，濃度為1 mg/ml。用XZ1000型噴膜機(jī)點(diǎn)膜，按1 μl/cm包被量在硝酸纖維膜(NC)上包被檢測線和對照線。包被好的NC膜置于37℃干燥箱干燥后，用2%小牛血清的PBS，37℃、封閉30分鐘，再用0.01 mol/L，pH7.4的 PBS漂洗，干燥后備用。

1.4 大腸桿菌O157:H7金標(biāo)檢測試劑盒制備 測試條由玻璃纖維、大腸桿菌O157:H7單抗-膠體金復(fù)合物玻璃纖維、包被硝酸纖維素膜、吸水濾紙和塑料襯板五部分組成，分別依此粘貼在白色塑料襯板上，切成0.4 cm×8.6 cm的條子，裝入塑料卡盒內(nèi)，置于鋁箔袋內(nèi)加干燥劑密封保存。

1.5 試劑盒的使用及結(jié)果判定 取100 μl的樣品滴加于檢測卡的加樣孔內(nèi)，若在檢測線和質(zhì)控線均出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢樣品中含有大腸桿菌O157:H7，判為陽性;若僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色條帶，表明待檢樣品中不含有大腸桿菌O157:H7抗原;若質(zhì)控線不出現(xiàn)紅色條帶，不論檢測線是否出現(xiàn)紅色條帶，均表示實(shí)驗(yàn)失敗或試劑盒失效。

1.6 大腸桿菌O157:H7試劑盒特異性檢測 將腸炎沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、宋內(nèi)氏志賀菌、單增李斯特桿菌、阪崎腸桿菌13種細(xì)菌培養(yǎng)物用PBS稀釋至107CFU/ml，分別對試劑盒進(jìn)行檢測。

1.7 大腸桿菌O157:H7試劑盒敏感性檢測 大腸桿菌O157:H7于LB肉湯37℃過夜培養(yǎng)，5 000 r/min離心10分鐘集菌，PBS(0.01 mol/L，pH7.4)重懸、稀釋，CFU計數(shù)，調(diào)整菌液濃度至104～109CFU/ml，100℃滅活15分鐘，每一稀釋度取100 μl加入樣品加樣孔，20分鐘內(nèi)觀察檢測結(jié)果。

1.8 大腸桿菌O157:H7試劑盒符合率檢測

1.8.1 陽性符合率 隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個試劑盒，檢測大腸桿菌陽性質(zhì)控品10份，測定時取50 μl陽性質(zhì)控品加在試劑盒加樣孔中，平放，等待3～10分鐘觀察試劑盒中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果。控制線和檢測線同時出現(xiàn)反應(yīng)可判讀為陽性;控制線反應(yīng)、檢測線不反應(yīng)時可判為陰性;控制線和檢測線不反應(yīng)時，則實(shí)驗(yàn)無效。

1.8.2 陰性符合率 隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取10個試劑盒，檢測大腸桿菌陰性質(zhì)控品10份，測定時取50 μl陰性質(zhì)控品加在試劑盒加樣孔中，平放，等待3～10分鐘觀察試劑盒中部檢視窗的結(jié)果，但不可超過20分鐘讀結(jié)果?？刂凭€和檢測線同時出現(xiàn)反應(yīng)可判讀為陽性;控制線反應(yīng)、檢測線均不反應(yīng)時可判為陰性;控制線和檢測線均不反應(yīng)時，則實(shí)驗(yàn)無效。

1.9 大腸桿菌O157:H7試劑盒重復(fù)性檢測 隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取20個試劑盒，檢驗(yàn)試劑盒的重復(fù)性。

1.10 大腸桿菌O157:H7試劑盒精密性檢測 隨機(jī)從3批待測試劑盒中各抽取10個試劑盒檢測大腸桿菌陽性質(zhì)控品。測定方法和結(jié)果判定同上

1.8.1.結(jié)果判定及結(jié)果統(tǒng)計:檢測同一份大腸桿菌陽性質(zhì)控品時，各試劑盒之間的檢測線和對照線顯色應(yīng)均勻一致，每批重復(fù)測定10個試劑盒，對3個批次之間試劑盒的檢測線和對照線顯色結(jié)果變異系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，按照公式計算批間變異系數(shù)(CV值)。CV=(最大變異數(shù)-最小變異數(shù))/總樣本數(shù)×100%。

1.11 大腸桿菌O157:H7試劑盒穩(wěn)定性檢測 將3批次的試劑盒置于干燥器內(nèi)，分別保存于37℃和室溫條件下，每隔30天取出不同批次存放的試劑盒進(jìn)行外觀及功能檢驗(yàn)，與新制備的試劑盒平行檢測陽性和陰性樣本，比較檢測結(jié)果，檢驗(yàn)試劑盒的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 特異性 用該試劑盒檢測107CFU/ml菌量的腸炎沙門氏菌、丙型副傷寒沙門氏菌、甲型副傷寒沙門氏菌、乙型副傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、嬰兒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157、宋內(nèi)氏志賀菌、單增李斯特桿菌、阪崎腸桿菌均為陰性。

2.2 敏感性 用上述不同稀釋倍數(shù)的菌懸液測試上述的3批試劑盒，結(jié)果表明該菌懸液的最低檢出菌量為104CFU/ml。

2.3 符合率 經(jīng)檢測10份陽性質(zhì)控品，檢測線全部出現(xiàn)反應(yīng)，符合率為100%;10份陰性質(zhì)控品的檢測線均不出現(xiàn)反應(yīng)，符合率為100%;總體陰陽性符合率良好。

2.4 重復(fù)性 隨機(jī)從同批待測試劑盒中抽取20份試紙條，測定陰性和陽性樣本，結(jié)果顯示檢測結(jié)果一致，表明該試劑盒重復(fù)性良好。

2.5 精密性 檢測相同濃度的陽性質(zhì)控品，3個批次之間的試劑盒的檢測線和對照線顯色均勻一致，CV=0。

2.6 穩(wěn)定性 用置于37℃和常溫存放不同時間的試劑盒與新制備的試劑盒平行檢測陽性和陰性標(biāo)本，結(jié)果表明37℃保存和常溫保存的試劑盒在檢測陽性質(zhì)控品時均一性仍為100%，該試劑盒穩(wěn)定性良好。

3 討論

膠體金免疫層析試驗(yàn)是20世紀(jì)80年代在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、乳膠凝集試驗(yàn)、單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種獨(dú)特的免疫分析方式[8]。其原理是將特異的抗體或抗原先固定于NC膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的NC膜一端浸入樣品后，由于毛細(xì)管虹吸作用，樣品將沿著該膜向前移動。當(dāng)移動至固定有抗體或抗原的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原或抗體即與該抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，若用免疫膠體金可使該反應(yīng)顯示紅色條帶，從而實(shí)現(xiàn)特異性的免疫診斷[9，10]。實(shí)驗(yàn)無需特別儀器設(shè)備，操作簡單快速，可在1～5分鐘內(nèi)獲得檢測結(jié)果，尤其適合野外和基層現(xiàn)場檢測樣品的快速篩查。目前，膠體金免疫層析技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于病原微生物、激素、疾病相關(guān)蛋白以及藥物的檢測。

本研究制備的雙抗體夾心法O157:H7金標(biāo)檢測試劑盒的設(shè)計原理是:將被檢樣品滴加到試劑盒后，若被檢樣品中含有被檢抗原O157:H7，膠體金標(biāo)記單克隆抗體7G2便與檢測樣品中的O157:H7抗原結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物隨液體在NC印膜上擴(kuò)散的過程中，則被印膜上的單克隆抗體7F9印跡結(jié)合固定，則呈現(xiàn)棕紅色檢測線，羊抗鼠IgG印跡則可結(jié)合固定金標(biāo)記抗體，呈現(xiàn)紅色陰性對照線，此時出現(xiàn)兩條棕紅色反應(yīng)線，即為陽性結(jié)果。當(dāng)被檢樣品中不含被檢抗原O157:H7時，則無抗原抗體復(fù)合物形成，印膜上的單克隆抗體7F9印跡不能結(jié)合固定膠體金標(biāo)記單克隆抗體7G2，不呈現(xiàn)紅色檢測線，但羊抗鼠IgG印跡則可結(jié)合固定膠體金標(biāo)記單克隆抗體7G2(鼠源性單克隆抗體總是可以與羊抗鼠IgG結(jié)合)，呈現(xiàn)紅色對照線，此時只出現(xiàn)1條紅色對照線，即為陰性結(jié)果。無論檢測何種樣品，試劑盒的對照線應(yīng)該總是顯示的，若不顯示，則表明操作有誤或試劑盒失效，因此，試劑盒的對照線又稱為質(zhì)控線。

在膠體金金標(biāo)檢測試劑盒的制備過程中有諸多因素需要優(yōu)化，包括:膠體金顆粒的大小、膠體金標(biāo)記蛋白的pH與蛋白濃度、玻璃纖維素膜、硝酸纖維素膜以及噴涂檢測線和對照線使用的抗體濃度等。實(shí)驗(yàn)所用的玻璃器皿需要潔凈，均需泡酸處理。單克隆抗體的特異性、效價及純度對試紙條功效至關(guān)重要，本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記膠體金選用的O157:H7特異單克隆抗體7G2經(jīng)Protein G親和層析柱純化后，其純度和效價均可達(dá)到免疫膠體金的標(biāo)記要求，制成的O157:H7膠體金標(biāo)檢測試劑盒敏感性高，特異性強(qiáng)，簡便快速，不需要任何儀器設(shè)備，在1～5分鐘內(nèi)可得出檢測結(jié)果，便于O157:H7的臨床快速診斷與現(xiàn)場檢測樣品的快速篩查。

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