鄭曉強 陳君敏 (福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院血液科，福建 福州 350000)

目前研究表明，骨髓瘤骨病(MBD)患者的OB存在發(fā)育障礙〔1〕，具體機制尚不明確。Runx2是調控OB發(fā)育的關鍵因子〔2〕，其是否參與MM骨形成障礙的機制，國內尚未見有報道。本文建立骨髓瘤細胞株和MSCs共培養(yǎng)體系，研究骨髓瘤細胞對MSCs生物特性和Runx2表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 MM細胞系U266細胞株由福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所饋贈，L-DMEM培養(yǎng)基干粉、PBS粉劑、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司)，人淋巴細胞分離液(上海試劑二廠，比重1.077±0.001)，新生胎牛血清、青鏈霉素(Hyclone公司)，地塞米松、β-甘油磷酸鈉、維生素 C(美國 Sigma公司)，BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒(碧云天生物技術研究所)，引物合成(上海生工)，Trizol液(Tri Reagent公司)，cDNA第一鏈合成試劑盒(Fermentas公司)，聚合酶鏈反應試劑、標記物、焦碳酸二乙酯、PCR Master Mix、瓊脂糖(廈門泰京生物工程有限公司)，異丙醇、氯仿，無水乙醇、多聚甲醛、中性紅、硝酸銀、硫代硫酸鈉(上海試劑總廠)。

1.2 方法

1.2.1 骨髓MSCs的培養(yǎng) 骨髓標本來源于2例缺鐵性貧血患者和1例特發(fā)性血小板減少性紫癜患者，平均年齡(58.8±5.63)歲。抽取骨髓液5 ml，加入肝素管中，顛倒混勻防止凝固。加入等體積PBS，混勻，1 000 r/min離心5 min，去除脂肪及上清。加入等體積PBS，吹打混勻。將細胞懸液加至盛有等體積淋巴細胞分離液的離心管中，2 500 r/min離心30 min。收集中間層面云霧狀單個核細胞層，L-DMEM培養(yǎng)液(為含10%新生胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/L鏈霉素的低糖DMEM)洗滌細胞，1 000 r/min離心5 min。調整細胞密度為106/ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱。培養(yǎng)5 d后首次換液，以后每3天換液，每日倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況。當細胞匯合到90%時(約兩周)，用0.25%胰蛋白酶消化，按1∶2比例傳代。

1.2.2 MM細胞系(U266細胞株)的培養(yǎng) MM細胞系U266細胞株由福建醫(yī)科大學附屬協(xié)和醫(yī)院血液病研究所饋贈，在LDMEM培養(yǎng)液，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。每3天換液，U266細胞株為懸浮細胞，換液和傳代時，用吸管吹打培養(yǎng)瓶底，吸取培養(yǎng)液于一離心管，PBS洗滌3次，L-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，接種于培養(yǎng)瓶中，置入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。U266細胞株的傳代培養(yǎng)按 1∶2或 1∶3接種。

1.2.3 U266細胞株和MSCs共培養(yǎng)體系的建立 MSCs培養(yǎng)至3～5代，L-DMEM培養(yǎng)液重懸105個MSCs，接種于6孔板中，培養(yǎng)液定容為2 ml，待細胞60% ～70%融合時，吸凈孔板中的培養(yǎng)液，PBS洗3次，換為含地塞米松(10－8mol/L)、維生素C(0.05 g/L)和β-甘油磷酸鈉(10－2mol/L)的L-DMEM條件培養(yǎng)液，用條件培養(yǎng)液重懸U266細胞株，接種106個細胞至上述6孔板進行共培養(yǎng)，每3天半量換液，未加U266細胞株的MSCs培養(yǎng)體系作為對照組。

1.2.4 共培養(yǎng)體系MSCs增殖能力 L-DMEM重懸第3～5代的MSCs，接種4 000～10 000個細胞至96孔板，待細胞60% ～70%融合時，換為條件培養(yǎng)液，接種10 000個U266細胞株進行干預，未加入U266細胞株的MSCs作為平行對照組，分別在第1～7天進行測定，按照CCK-8試劑盒說明書每隔24 h測量1板，連續(xù)測量7 d。測量步驟:吸凈孔板中培養(yǎng)液，增設1孔未接種細胞的孔調零，每孔加入100 μl無血清培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，在酶標儀450 nm處讀取OD值，打印數(shù)據(jù)。

1.2.5 共培養(yǎng)體系MSCs的OB形成能力 將培養(yǎng)至第3～5代MSCs接種105個細胞至放有載玻片的六孔板，每3天完全培養(yǎng)液換液，待細胞60% ～70%融合時，換為條件培養(yǎng)液，接種106個U266細胞株進行干預，未加入U266細胞株為對照組，每隔3 d條件培養(yǎng)液半量換液，于第14天和第28天分別進行ALP和Von Kossa染色。

1.2.6 共培養(yǎng)體系MSCs的Runx2的表達 將培養(yǎng)至第3～5代MSCs接種106個細胞至六孔板，每3天完全培養(yǎng)液換液，待細胞80%融合時，換為條件培養(yǎng)液，接種106個U266細胞株進行干預，未加入U266細胞株為對照組，72 h后，采用RT-PCR法檢測Runx2的表達，RT-PCR操作步驟:收集1×106個細胞置于一EP管，細胞總RNA提取及逆轉錄按試劑盒說明書進行操作。放置PCR儀進行擴增，引物序列如下:Runx2引物:上游:5'-TGCTGGAGTGATGTGGTTTTCT-3'，下游:5'-CCCCTGTTGTGTTGTTTGGTAA-3'，擴增片段長度為276 bp。內參GAPDH引物:上游:5'-ACCACAGTCCATGCCATCA-3'，下游5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，擴增片段長度450 bp。擴增條件:94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，52℃退火 50 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)后72℃延長10 min。取10 PCR產(chǎn)物，1%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，電壓為110 V，電流與電壓相對應，時間為40 min，緩沖液為0.5×TAE，指示劑為溴酚藍，凝膠成像自動分析儀下照相，并計算Runx2/GAPDH的平均光密度值。

2 結果

2.1 共培養(yǎng)組MSCs的增殖能力 U266細胞株和MSCs共培養(yǎng)3 d，與對照組相比，細胞增殖無明顯差異，AOD值分別為0.731±0.020和0.805±0.152，二者無差異(P＞0.05)，至第6天，共培養(yǎng)組和對照組的 AOD值分別為0.560±0.034和2.283±0.145，差異顯著(P＜0.01)。

2.2 共培養(yǎng)組MSCs的OB形成能力 U266細胞株和MSCs在條件培養(yǎng)液誘導下共培養(yǎng)14 d，ALP染色結果顯示，共培養(yǎng)組ALP表達明顯低于對照組(P＜0.05)，IOD sum/Area sum值分別為0.138±0.038和0.376±0.044，誘導28 d，Von-Kossa染色顯示，共培養(yǎng)組鈣結節(jié)個數(shù)明顯少于對照組(P＜0.01)，平均鈣結節(jié)個數(shù)分別為(6.7±2.75)個和(15.3±8.99)個。

2.3 共培養(yǎng)組MSCs Runx2的表達 共培養(yǎng)組和對照組MSCs誘導72 h后，采用RT-PCR技術檢測Runx2 mRNA的表達量，結果顯示，共培養(yǎng)組MSCs Runx2的表達明顯低于對照組(P＜0.01)，Runx2/GAPDH平均光密度值分別為0.238±0.168和0.653±0.343。

3 討論

MM患者中存在OB發(fā)育障礙近年受到廣泛關注。組織形態(tài)學發(fā)現(xiàn)，與正常人相比，MM患者OB數(shù)量減少，功能下降。造成MM患者OB發(fā)育障礙的機制還不清楚，可能的是，骨髓瘤細胞在其中起著重要作用，為此，作者根據(jù)MM細胞系U266細胞株在體外培養(yǎng)屬懸浮生長型細胞、MSCs為貼附生長型細胞、兩者在L-DMEM培養(yǎng)液體系均能正常生長這些特點，建立U266細胞株和MSCs的共培養(yǎng)體系，研究骨髓瘤細胞是否影響MSCs的增殖及其向OB分化的能力，結果表明骨髓瘤細胞存在時正常MSCs的增殖及OB形成能力均降低。

骨髓瘤細胞抑制MSCs增殖和OB形成能力其確切的機制還不明了，可能與骨髓瘤細胞表達的某些抑制細胞因子與OB的發(fā)育有密切關系，Runx2是OB分化的特異性標志，在OB發(fā)育過程起重要作用，骨組織活檢的結果表明，與患有MM但未進展為骨病的患者相比，MBD患者Runx2陽性細胞的數(shù)量明顯減少〔3〕。體外實驗也證實，骨髓瘤細胞可抑制Runx2基因的活性〔4〕，本文研究結果表明，U266細胞株和MSCs共培養(yǎng)72 h時，MSCs Runx2的表達下降。這一觀點也有其他研究證據(jù)的支持。Bataille等對骨組織用形態(tài)計量學分析的結果表明，MM患者Runx2表達明顯低于正常人〔3〕。Prince等〔5〕研究認為，MSCs向OB分化過程中，Runx2的表達與OB形成能力呈正相關，可調節(jié)OB成熟標志物ALP、降鈣素和I型膠原的表達。除此之外，Runx2動力模型實驗也證實OB的形成和Runx2的表達呈正相關〔2，5〕。骨髓瘤細胞抑制MSCs Runx2表達的機制還有待研究，目前還沒有充分的事實表明抑制OB發(fā)育的因子(DKK1、sFRP-2、IL-3和IL-7等)與Runx2的降低有相關性，但有研究認為，MM患者MSCs的Runx2表達的降低可能與細胞表面黏附分子VLA-4整合素和血管內皮黏附分子-1(VCAM-1)有關〔6，7〕。因此有理由認為，骨髓瘤細胞抑制MSCs Runx2的表達更可能的機制是通過細胞與細胞間的直接接觸所造成的，這些都需要進一步的研究。

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3 Bataille R，Chappard D，Marcelli C，et al.Recruitment of new osteoblasts and osteoclasts is the earliest critical event in the pathogenesis of human multiple myeloma〔J〕.J Clin Invest，1991;88(1):62-66.

4 Giuliani N，Colla S，Morandi F，et al.Myeloma cells block RUNX2/CBFA1 activity in humanbone marrow osteoblast progenitors and inhibit osteoblast formation and differentiation〔J〕.Blood，2005;106(7):2472-83.

5 Prince M，Banerjee C，Javed A，et al.Expression and regulation of Runx2/Cbfa1 and osteoblast phenotypic markers during the growth and differentiation of human osteoblasts〔J〕.J Cell Biochem，2001;80(4):424-40.

6 Mori Y，Shimizu N，Dallas M，et al.Anti-alpha4 integrin antibody suppresses the development of multiple myeloma and associated osteoclastic osteolysis〔J〕.Blood，2004;104(7):2149-54.

7 Michigami T，Shimizu N，Williams PJ，et al.Cell-cell contact between marrow stromal cells and myeloma cells via VCAM-1 and alpha(4)beta(1)-integrin enhances production of osteoclast-stimulating activity〔J〕.Blood，2000;96(5):1953-60.