程 潔 朱 毅 李忠仁 (南京中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院,江蘇 南京 210046)

鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM,也稱鈣調(diào)素)是迄今發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)最重要的鈣受體蛋白。Ca2+作為第二信使對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)大多是通過各種鈣結(jié)合蛋白(CaBP)介導(dǎo)的?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的多種 CaBP,多存在于特定的組織中,從而表現(xiàn)其特殊功能。在各種 CaBP中,研究最多、最重要的是 CaM,它廣泛存在于各種組織中。

1 CaM的生物活性和分布〔1〕

CaM是一種能與 Ca2+結(jié)合的蛋白質(zhì),它由 148個(gè)氨基酸殘基組成一條長鏈,其中天門冬氨酸及谷氨酸占 1/4。這種蛋白質(zhì)分子上有 4個(gè)位點(diǎn)可與 Ca2+結(jié)合,因此一分子 CaM可與 4個(gè) Ca2+結(jié)合(這 4個(gè)結(jié)合部位由 4個(gè)“螺旋-袢-螺旋”結(jié)構(gòu)組成)。當(dāng)CaM與 Ca2+結(jié)合,即成為有活性的鈣-CaM復(fù)合物(Ca2+-CaM)。CaM作為細(xì)胞中一種重要的多功能蛋白,可以激活 40多種酶或者通道,參與許多生物功能,如肌肉收縮、突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)的合成與釋放、激素分泌和基因表達(dá)等。

CaM存在于脊椎和無脊椎動(dòng)物、植物、原生動(dòng)物的所有組織中的幾乎所有真核細(xì)胞內(nèi),在腦內(nèi)主要分布在海馬、紋狀體和大腦皮層,大約占腦蛋白的 0.5%。CaM存在于神經(jīng)元的許多亞細(xì)胞成分中,在胞漿液、線粒體、微粒體、突觸泡漿和突觸膜等部分都有分布,其濃度與腦的正常功能有重要的聯(lián)系。

2 CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載與氧自由基的生成

2.1 腦缺血再灌注損傷時(shí)Ca2+與CaM的變化 腦缺血再灌注引起腦損傷的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜,包括興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、自由基生成、一氧化氮(NO)大量釋放、細(xì)胞酸中毒、凋亡基因激活等。這些環(huán)節(jié)互為因果,相互影響,形成惡性循環(huán),最終導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性壞死。有學(xué)者提出細(xì)胞內(nèi)鈣超載的損害作用是細(xì)胞死亡的“最后共同通路”〔2〕。而 CaM作為細(xì)胞內(nèi)鈣的主要受體蛋白,在介導(dǎo)Ca2+在腦缺血過程中起著重要的調(diào)控作用。

腦缺血再灌注損傷發(fā)生后,神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯上升,其主要途徑有兩條:一是細(xì)胞外鈣離子通過包埋于細(xì)胞膜上的鈣通道進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),另一條是細(xì)胞內(nèi)鈣儲存池(主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及肌漿網(wǎng))中鈣離子的釋放。在細(xì)胞質(zhì)膜上存在兩種性質(zhì)完全不同的鈣離子通道,電壓依賴性鈣通道(voltage-operated Ca2+channels,VOCC)和配體門控鈣離子通道(1igand-gated calcium channel,LGCC),而在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上則存在受體操縱性通道(Store-operator Channel,SOC),這樣,鈣離子進(jìn)入胞漿的模式就主要有三種:第一種和第二種是細(xì)胞外鈣分別通過 VOCC及LGCC進(jìn)入胞漿;第三種是鈣儲存池中鈣離子通過SOC通道釋放入胞漿。VOCC包括 L-,N-,T-,P-,Q-,R-六種,其中以 LVOCC發(fā)揮主導(dǎo)作用,LGCC為谷氨酸受體,主要包括兩種亞型:N-甲基 D-天冬氨酸(NMDA)受體及 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-丙酸哇酮(AMPA)受體,其中 NMDA受體對 Ca2+具有高度通透性〔3,4〕。

研究表明〔5,6〕,腦缺血再灌注后,隨著神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)的Ca2+超載,腦組織的CaM活性和含量也明顯升高,再灌注后的升高較腦缺血后更為顯著。

2.2 CaM對神經(jīng)元細(xì)胞Ca2+超載的調(diào)控

2.2.1 CaM介導(dǎo) VOCC的 Ca2+依賴性失活和易化 VOCC介導(dǎo)的Ca2+超載參與許多細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)過程,其中對通道自身活動(dòng)的調(diào)控就是一種重要的形式。這種自調(diào)控包括使通道開放減少的失活作用(inactivation)和使通道開放增強(qiáng)的易化作用(faeilitation)〔7〕。這兩種類型的自調(diào)控對細(xì)胞重復(fù)活動(dòng)時(shí)的Ca2+流量及其下游活動(dòng)都有十分重要的影響。許多試驗(yàn)〔8～11〕證明:Ca2+-CaM介導(dǎo)了VOCC的失活和易化。Ca2+-CaM除了對 L型Ca2+通道有調(diào)控作用外,對神經(jīng)元中的 P/Q,N和 T型Ca2+通道也有影響。

2.2.2 CaM調(diào)控NMDA受體對 Ca2+超載的影響 有研究表明〔12〕CaM對 NMDA受體有直接作用。CaM抑制劑三氟拉嗪(TFP)可以通過作用于 NMDA受體抑制Ca2+的內(nèi)流,明顯降低谷氨酸導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷,提示 TFP可能通過作用 CaM,進(jìn)而影響 NMDA受體的開放〔13〕。這對阻止 Ca2+內(nèi)流對腦缺血再灌注損傷有重要意義。

國內(nèi)外學(xué)者在應(yīng)用 CaM抑制劑治療腦缺血的研究中發(fā)現(xiàn)〔14～16〕,多種 CaM抑制劑可抑制神經(jīng)原細(xì)胞的 Ca2+內(nèi)流,從而抑制腦缺血對神經(jīng)損傷的作用,縮小梗死面積;但具體通過抑制CaM對哪一種或幾種途徑的Ca2+內(nèi)流產(chǎn)生抑制尚待進(jìn)一步研究。

2.3 細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載與自由基的生成 腦缺血時(shí),細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可通過以下途徑使自由基產(chǎn)生進(jìn)一步急劇增多〔17〕。①激活蛋白水解酶,使黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶,同時(shí)促進(jìn) ATP的降解而生成大量次黃嘌呤,如此時(shí)再灌注,在帶入大量氧的情況下,黃嘌呤氧化酶作用于次黃嘌呤,便在生成黃嘌呤的同時(shí),產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基(O-2);O-2在三價(jià)鐵離子的催化下與 H2O生成 H2O2,后經(jīng) Haber-weiss反應(yīng)而生成毒性更強(qiáng)的羥自由基(OH-),從而啟動(dòng)了自由基生成連鎖反應(yīng),通過瀑布反應(yīng),可產(chǎn)生更多的自由基如烷自由基、烷氧自由基等。②激活磷脂酶 A2(PLA2)和磷脂酶 C(PLC),使膜磷脂降解,游離脂肪酸特別是花生四烯酸(AA)大量釋放。AA在環(huán)氧化酶、脂氧化酶作用下進(jìn)一步形成白三烯,此代謝過程伴自由基產(chǎn)生。③腦缺血時(shí)腦細(xì)胞線粒體內(nèi)Ca2+增多,三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙,不能為電子傳遞鏈的細(xì)胞色素氧化酶提供足夠的電子,O2發(fā)生自還原生成O-2并漏出線粒體,成為自由基損傷的重要來源。

3 CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與 NO的合成

3.1 NO合酶(NOS)與NO的合成 NO是一種自由基性質(zhì)的氣體,其結(jié)構(gòu)簡單又極不穩(wěn)定,具脂溶性,能自由地通過細(xì)胞膜,并呈高化學(xué)反應(yīng)性。在體內(nèi),NO是在 NOS催化下由 L-精氨酸氧化產(chǎn)生。生成的 NO可被氧自由基、血紅蛋白等迅速滅活。有氧條件下,亞硝酸鹽(NO-2)、硝酸鹽(NO-3)是NO主要而穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。目前已知,NOS可分為神經(jīng)元型(nNOS),內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS)三種,nNOS和 eNOS又合稱結(jié)構(gòu)性 NOS(cNOS)。其中 nNOS生成的 NO通過抑制含F(xiàn)e2+離子的酶活性,促進(jìn)超氧亞硝酸陰離子(ONOO-)等超氧陰離子的生成,介導(dǎo)谷氨酸相關(guān)的神經(jīng)毒性作用等機(jī)制在腦缺血中起有害作用。另外,NO分子可以與超氧陰離子()反應(yīng),生成毒性更大的 ONOO-,并降解為 OH-、自由基〔18〕。

3.2 CaM在 NO合成中的作用 cNOS是一個(gè)雙區(qū)結(jié)構(gòu),C-端為還原酶區(qū),N-端為氧化酶區(qū)。還原酶區(qū)含有 NADPH、FAD、FMN和 CaM結(jié)合位點(diǎn),氧化酶區(qū)含有血紅素(heme)、四氫葉酸(BH4)和 L-精氨酸的結(jié)合位點(diǎn)〔19〕。CaM為結(jié)構(gòu)性 NOS(cNOS,包括 nNOS和 eNOS)生成 NO所必需。

當(dāng) Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)形成 Ca2+-CaM,與 cNOS結(jié)合可導(dǎo)致酶的激活。CaM作為一個(gè)分子開關(guān),允許電子流從 NOS經(jīng)基端還原酶區(qū)域流向氨基端含血紅素區(qū)域。當(dāng) CaM未結(jié)合時(shí),還原酶區(qū)域不能供應(yīng)電子給血紅素;結(jié)合后,有關(guān)電子傳遞體排列在一起,電子流穿過 NOS活性部位,從而開啟 NO合成〔20〕。由于 NOS合成 NO需要 CaM的參與,因此,抑制 CaM的活性會影響 NO的合成。CaM抑制劑對缺氧時(shí) NO的合成產(chǎn)生影響。

4 結(jié)束語

CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腦缺血再灌注的氧化應(yīng)激發(fā)生中起重要作用主要體現(xiàn)在:①通過對細(xì)胞內(nèi) Ca2+超載的調(diào)控作用,直接影響了氧自由基生成連鎖瀑布反應(yīng)。②參與了 NOS合成NO的過程。因此,在理論上抑制CaM的活性會減少自由基和NO的生成。而缺血后腦組織損害的實(shí)質(zhì)是自由基引起神經(jīng)細(xì)胞生物膜及亞細(xì)胞器過氧化,造成結(jié)構(gòu)及功能的破壞,最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。多種 CaM抑制劑可抑制神經(jīng)原細(xì)胞的 Ca2+內(nèi)流,從而抑制腦缺血對神經(jīng)損傷的作用,縮小梗死面積。實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否與通過抑制 CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在腦缺血再灌注中的氧化應(yīng)激有相關(guān)性,尚缺乏報(bào)道,有待進(jìn)一步探索。已有研究表明〔21,22〕電針能調(diào)節(jié)腦缺血大鼠腦組織CaM及 Ca2+濃度。以往的研究表明〔23,24〕電針可間接或直接預(yù)防及逆轉(zhuǎn)腦缺血再灌流所造成的脂質(zhì)過氧化及自由基連鎖反應(yīng),并具有良好的抗氧應(yīng)激和腦的保護(hù)作用。但是,針刺對腦缺血再灌流大鼠的抗氧應(yīng)激作用是否與其對 CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的良性調(diào)控有關(guān)還不明確。針刺后CaM濃度的變化是否會影響NO的生成;與一些抗氧化劑,如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)等的關(guān)系如何;以及其對總體抗氧化能力的影響,也是值得探討的問題。因此,與 CaM抑制劑相對照,研究針刺對CaM信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控與對腦缺血再灌注抗氧應(yīng)激作用之間的關(guān)系,有利于揭示針灸抗氧應(yīng)激的蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,為各種相關(guān)疾病的針灸診治及預(yù)防提供新的思路。

1 董先平,智 剛,徐天樂 .鈣調(diào)素參與離子通道和受體功能的調(diào)控〔J〕.自然科學(xué)進(jìn)展,2002;12(3):232-9.

2 Szabo I,Ioratti M.The giant channel of the inner mitochondrial membrane is inhibited by cyclosporin A〔J〕.JBiol Chem,1991;266(6):3376-9.

3 Soderlnig TR.The Ca2+-CaM dependent protein kinase cascade〔J〕.Ternds Bio chem Sci,1999;24(2):232-6.

4 Rottnigen J,Iversen JG.Ruled by waves?Intracellular and intercellular calcium signalling〔J〕.Acta Physiol Scand,2000;169(3):203-19.

5 李露斯,梁志堅(jiān).完全性腦缺血大鼠腦勻漿鈣調(diào)蛋白、游離脂肪酸及其代謝產(chǎn)物含量的變化〔J〕.中國神經(jīng)精神疾病雜志,1990;16(1):13-5.

6 徐 仁,孫圣剛,梅元武,等 .線粒體鈣、鈣調(diào)素、興奮性氨基酸、丙二醛在腦缺血再灌注中變化的實(shí)驗(yàn)觀察〔J〕.腦與神經(jīng)疾病雜志,1999;7(5):261-3.

7 Ehlers MD,Augustine GJ.Calmodulin at the channel gate〔J〕.Nature,1999;399(6732):105,107-8.

8 Zühlke RD,Pitt GS,Deisseroth K,et al.Calmodulin supportsboth inactivation and failitation of L-type calcium channels〔J〕.Nature,1999;399(6732):159-62.

9 Tsien RW,Ellinor PT,Home WA,et al.Molecular diversity of voltage-dependent Ca2+channels〔J〕.Trends Pharmacol Sci,1991;12(9):349.

10 Lee A,Wang ST,Gallagher D,et al.Ca2+/calmodulin binds to and modulate P/Q-type caleium channels〔J〕.Narure,1999;399(6732):155.

11 Dunlap K,Luebke JI,Turner TJ.Exocytotic Ca2+channelsin mammalian central neurons〔J〕.Trends Neurosci,1995;18(2):89-98.

12 Saimi Y,Kung C.Calmodulin as an ion channel subunit〔J〕.Annu Rev Physiol,2002;64:289-311.

13 張 目.鈣調(diào)蛋白抑制劑三氟拉嗪抗腦缺血作用與機(jī)制研究〔D〕.浙江大學(xué)博士學(xué)位論文,2003:69.

14 Sun X,Shin C,Windebank AJ.Calmodulin in ischemic neurotoxicity of rat hippocampus in vitro〔J〕.Neuroreport,1997;8(2):415-8.

15 Stelmashuk EV,Andreeva NA,Manukllova L,et al.Bifonazole modulatesdeath of cultured cerebellar granular cells induced by glutamate and oxygen-glucose deprivation〔J〕.Bull ExPBiol Med,2001;132(5):1076-8.

16 Kuroda S,Nakai A,Kristian T,et al.The calmodulin antagonist trifluoperazine in transient focal brain ischemia in rats.Anti-ischemic effect and therapeutic window〔J〕.Stroke,1997;28(12):2539-44.

17 韓仲巖.自由基與鈣超載〔J〕.山東醫(yī)藥,1994;34(2):38-9.

18 Lipton SA,Choi YB,Pan ZH,et al.A redox-based mechanism for the neuroprotective and neurodestructive of effects nitric oxide and related nitroso-compounds〔J〕.Nature,1993;364(6438):626-32.

19 鐘慈聲,孫安陽.一氧化氮的生物醫(yī)學(xué)〔M〕.上海:上海醫(yī)科大學(xué)出版社,1997:32.

20 Masuoka A,Stuehr DJ,Olson JS.L-arginine and calmodulin regulation of the heme iron reactivity in neuronal nitric oxide synthase〔J〕.J Biol Chem,1994;269(32):20335-9.

21 金智秀,郝晉東,盧 峻,等 .不同時(shí)間窗電針對急性局灶性腦缺血模型大鼠腦組織活性鈣調(diào)素含量影響的研究〔J〕.針刺研究,2003;28(3):178-81.

22 姚 凱,郭 義,胡利民,等 .針刺對大鼠腦缺血超早期腦細(xì)胞內(nèi)外游離鈣離子濃度的影響〔J〕.中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2005;12(5):303-5.

23 李忠仁,崔 龍,郭志力,等 .電針對腦缺血再灌流腦組織損傷的抗氧應(yīng)激研究〔J〕.針刺研究,2005;30(2):67-71.

24 穆艷云,李忠仁,牛文民,等 .電針對局灶性腦缺血再灌注大鼠紋狀體線粒體 ATP酶與總體抗氧化能力的影響〔J〕.上海針灸雜志,2007;26(1):42-4.