丁玉芹，姜 宏，汪存利

(安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽合肥 230031)

絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，有報(bào)道［1］其家族成員細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellularsignal regulated protein kinase，ERK)和p38MAPK定位于精子尾部中段，參與精子活動(dòng)力的調(diào)節(jié);17-β雌二醇可通過PI3K/Akt通路激活ERK，增加精子活動(dòng)力，并且ERK是在精子由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檫\(yùn)動(dòng)過程中逐漸被活化的，抑制內(nèi)源性ERK可以使精子鞭毛活力下降［2-3］。從理論上講，增加或降低ERK和p38的活性可調(diào)節(jié)精子活動(dòng)力。鑒于此，我們以ERK和p38信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路特異性抑制劑PD98059和SB203580作用于精子細(xì)胞，旨在探討PD98059和SB203580對(duì)精子ERK和p38MAPK及精子活動(dòng)力的調(diào)節(jié)作用，為弱精子癥的發(fā)病機(jī)制和臨床治療途徑作一探索。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象研究對(duì)象來自于解放軍105醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心門診的男性不育患者，按照世界衛(wèi)生組織精液分析標(biāo)準(zhǔn)(1999)，分別收集正常對(duì)照組和弱精子癥組標(biāo)本各15份。每份標(biāo)本均經(jīng)兩次以上檢查核實(shí)，且巴氏染色后精子正常形態(tài)率均＞15%。為避免其它細(xì)胞(生精細(xì)胞、白細(xì)胞和上皮細(xì)胞)的污染，按文獻(xiàn)方法［4］，收集精子，PBS調(diào)整精子密度至50 ×106/ml，備用。

1.2PD98059和SB203580對(duì)精子活動(dòng)力的影響

1.2.1濃度對(duì)精子活力的影響 將正常對(duì)照組和弱精癥組樣本按每孔100 μl分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為空白對(duì)照組、不同濃度PD98059組和不同濃度SB203580組，每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔取其平均值。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)溫育1 h后，Malker精子計(jì)數(shù)板檢測(cè)各組精子活動(dòng)力。

1.2.2 作用時(shí)間對(duì)精子活力的影響將正常組和弱精癥組精液樣本按每孔100 μl接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別加入濃度實(shí)驗(yàn)中對(duì)精子活動(dòng)力影響最佳濃度的PD98059，分為空白對(duì)照組、80 μmol·L-1PD98059 組和 60 μmol·L-1SB203580組，置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)分別溫育 10、20、40、60 min，觀察PD98059和SB203580干預(yù)不同時(shí)間精子活動(dòng)力的變化。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔取其平均值，收集精子，儲(chǔ)存于-196℃液氮中備用。

1.3ERK和p38磷酸化和蛋白表達(dá)水平測(cè)定取出精子沉淀，用Wsetern blot檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)ERK和p38磷酸化和蛋白表達(dá)水平，Quantity One分析軟件分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，各組間的差異性比較采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1不同濃度的PD98059和SB203580對(duì)精子活動(dòng)力的影響正常精子活動(dòng)力隨PD98059濃度的增加逐漸下降，80 μmol·L-1的PD98059對(duì)精子活動(dòng)力的抑制程度最大;加入SB203580后弱精癥患者精子活動(dòng)力逐漸增加，濃度60 μmol·L-1時(shí)精子活動(dòng)力升高最為明顯。

2.2PD98059和SB203580作用時(shí)間對(duì)精子活動(dòng)力的影響隨著PD98059作用時(shí)間的延長(zhǎng)，精子活動(dòng)力逐漸下降，作用40 min精子活動(dòng)力最低;而SB203580作用10 min后，精子活動(dòng)力明顯上升，隨著作用的時(shí)間延長(zhǎng)精子活動(dòng)力呈下降趨勢(shì)。

2.3PD98059和SB203580作用后精子PERK和pp38變化80 μmol·L-1PD98059作用于正常精子40 min后，總ERK表達(dá)水平無明顯變化，但PERK/ERK比值明顯下降，兩組比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。60 μmol·L-1SB203580作于弱精子組精子10 min后總p38表達(dá)水平無明顯變化，但pp38/p38比值明顯下降(P＜0.05)。

3 討論

PD98059是Ras-MAPK通路蛋白激酶MEK(MAPKK)的特異性抑制劑，可特異性地抑制MAPK的磷酸化而阻斷細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［5］。SB203580則作用于 p38與 ATP的結(jié)合位點(diǎn)Thr106，可使p38喪失與ATP的結(jié)合能力，從而使其失去激酶活性。本研究中，我們將不同濃度的 PD98059和SB203580分別作用于正常精子和弱精癥患者精子，發(fā)現(xiàn)正常精子隨PD98059作用時(shí)間的延長(zhǎng)活力逐漸下降，而弱精子癥患者精子則在SB203580作用短時(shí)間內(nèi)活力升高，表明MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)精子活動(dòng)力中起重要作用。免疫印跡技術(shù)檢測(cè)也證實(shí)在PD98059干預(yù)后，伴隨著精子活力的降低，ERK的磷酸化水平明顯受抑制，活性下降;而SB203580干預(yù)后，隨精子活力的提高，p38的磷酸化水平明顯受抑制，活性亦下降，進(jìn)一步證實(shí)PD98059和SB203580可通過MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)精子活動(dòng)力。

我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到，PD98059和SB203580對(duì)精子活動(dòng)力的調(diào)節(jié)在短時(shí)期內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴性，但是PD98059和SB203580并不能完全抑制MAPK的活性，這可能與精子細(xì)胞內(nèi)存在一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)，除了MAPK通路外還存在其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。從信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路入手可以更精確地探討弱精癥發(fā)病的分子機(jī)制，并為研發(fā)治療弱精癥的新藥物提供一定理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Almog T，Lazar S，Reiss N，et al.Identification of extracellular signal regulated kinase1/2 and p38MAPK as regulators of human sperm motility and acrosome reaction and as predictors of poor spermatozoa quality［J］.J Biol Chem，2008，283(21):14479-89.

［2］Aquila S，Sisci D，Gentile M，et al.Estrogen receptor(ER)alpha and ER beta are both expressed in human ejaculated spermatozoa:evidence of their direct interaction with phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt pathway［J］.J Clin Endocrinol Metab，2004，89(3):1443-51.

［3］Lu Q，Sun Q Y，Breitbart H，Chen D Y.Expression and phosphorylation of mitogen-activated protein kinases during spermatogenesis and epididymal sperm maturation in mice［J］.Arch Androl，1999，43(1):55-66.

［4］Ostermeier G C，Dix D J，Miller D，et al.Spermatozoal RNA profiles of normal fertile men［J］.Lancet，2002，360(9335):772-7.

［5］Wu J，Wong W W，Khosravi F，et al.Blocking the Raf/MEK/ERK pathway sensitizes acute myelogenous leukemia cells to lovastatininduced apoptosis［J］.Cancer Res，2004，64(18):6461-8.