馮 慧， 馮成利， 劉曉農(nóng)， 任 軼

(陜西省動物研究所， 陜西 西安 710032)

0 引 言

秦嶺山脈中有較多的動物群，有些動物已成為瀕危動物，有些動物兇狠不易靠近.為了發(fā)現(xiàn)瀕危動物，人們在山脈中去尋找，花費了大量的人力物力，卻很難得到成效.有些地方發(fā)現(xiàn)有野生動物的皮、肉出售，當執(zhí)法部門檢查時，出售者稱為人工養(yǎng)殖的，執(zhí)法人員很難區(qū)別人工養(yǎng)殖的還是野生動物，這為執(zhí)法者提出了新課題.另外由于環(huán)境的變化，野生動物也不停地進行變異，通過DNA的推測可以發(fā)現(xiàn)動物變異的規(guī)律.皮張標本為DNA提取的材料是非損傷性取樣的一種，是法醫(yī)學、遺傳進化和分子生態(tài)學研究的有效方法.館藏標本取樣方便而且相對于糞便和毛囊的非損傷性取樣選材范圍較廣；還可利用不同年限的館藏標本對動物的遺傳變異及遺傳多樣性進行研究分析，為制定相關的保護措施提供理論依據(jù)[1].為此，我們對秦嶺有蹄類保護動物遺傳多樣性及其變化進行了研究.本論文是其中的一部分.

1 材料與研究方法

1.1 樣品采集與保存

首先采集陜西省動物研究所標本室內(nèi)20世紀5、60年代的林麝熟制標本皮張和各森林公安送來的盜獵動物的新鮮肉.新采集的樣品，放入冰袋低溫保存，及時分裝、貼標，然后放入-80 ℃冰箱保存.

1.2 DNA的提取方法

試驗進行的同時使用抽提空管作為陰性對照，用新鮮肉做陽性對照.

1.2.1 林麝熟制皮張DNA提取

(1)從每個標本上剪取約0. 5 cm2的皮張，用1 mL 0.03 M Na2HPO4溶液在不斷振蕩條件下處理24 h，除去鉻離子[2].

(2)將標本用浸泡液(10 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCl，pH8. 0)浸泡24 h，棄浸泡液，用剪刀盡量剪碎，置于1. 5 mL離心管內(nèi)；向離心管內(nèi)加入500μL Nuclei Lysis Sol′n(Promega)，24μL 0.5 M EDTA，3μL 20 mg/mL蛋白酶K，在55 ℃下存放 3～5 h.

(3)12 000 r/min離心5 min，取200μL上清液于另一離心管中；向離心管中加入200μL Tris-飽和酚(pH8. 0)，輕輕地搖動混合10 min， 12 000 r/min離心10 min，重復此步驟一次.

(4)將上清移至一個新的1. 5 mL離心管中，再加入200μL 氯仿，輕輕地搖動混合10 min，12 000 r/min離心10 min，取上清并重復此步驟一次；取上清移入一個新的1. 5 mL離心管中，加入2. 5倍體積的冷無水乙醇，輕輕地搖動片刻，置于冰箱中于-20 ℃條件下冷凍3 h.

(5)13 000 r/min離心15 min，小心棄去上清；吸取200μL 70%乙醇洗滌片刻，13 000 r/min離心15 min，小心棄去上清，室溫下打開離心管蓋，使乙醇蒸發(fā)10～20 min.

(6)用30μL TE (10 mmol/L Tris-HCl、10 mmol/L EDTA，pH8. 0)緩沖液室溫下溶解DNA沉淀；用DNA定量提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進行二次提取[3].

為防止提取過程中外源DNA 的污染，用無菌濾紙代替皮質(zhì)標本作陰性對照，提取方法與其它樣品完全一樣.

1.2.2 肌肉DNA提取

(1)剪取米粒大小肌肉組織，加入5% Chelex-100(Bio-Rad)懸濁液和2μL 20 mg/mL蛋白酶K，于56 ℃保溫過夜.

(2)第二天早上取出，劇烈震蕩5～10 s后，放入100 ℃震蕩8 min，再劇烈震蕩5～10 s.

(3)13 000 r/min離心3 min，取50μL上清液用于擴增反應.

1.3 DNA質(zhì)量檢測

1.3.1 紫外吸收與瓊脂糖凝膠電泳檢測

紫外吸收檢測DNA的純度：將提取后的DNA樣品適當稀釋，采用紫外分光光度計測定在波長260 nm與280 nm處的吸收值，根據(jù)OD260/OD280值來判斷DNA的純度.

瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的完整性：將母液各取5 μL，采用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳，檢測降解程度，根據(jù)相對分子質(zhì)量標準判斷分子大小，在凝膠成像儀上觀察并照相.

1.3.2 PCR擴增

從皮張中提取的動物基因組DNA往往要用于PCR擴增等后續(xù)分子生物學操作[4]，DNA濃度和純度對結(jié)果影響較大, 因此提取的總DNA能否很好應用于擴增也是檢測DNA質(zhì)量的一個重要方面.根據(jù)NCBI上提供的林麝mtDNA Cytb區(qū)堿基序列，引物為L：5′-CAACTAACCTCCCTAAGACTTCAAG-3′， H：5′-CCAAATGTATGACAGCACAGTTATG-3′.采用25μL反應體積：10×緩沖液2.5μL，1.5μL MgCl2(25 mmol/L)，0.5μL dNTP(10 mmol/L)，引物(10μmol/L)各取1μL，0.5μL Taq DNA聚合酶(2 U/μL)，1μL模板總DNA.PCR反應條件為94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min，35循環(huán)；68 ℃延伸10 min.反應后4 ℃保存.

1.3.3 DNA擴增片段的測序

PCR產(chǎn)物在1.0%的瓊脂糖凝膠上電泳，擴增效果較好的樣品經(jīng)凝膠回收試劑盒回收后送上海英駿生物技術有限公司進行測序.

2 結(jié)果與分析

紫外吸收值的結(jié)果顯示，熟制標本皮張和新鮮肌肉提取到的DNA測得的OD260/OD280值均在1.75～1.85之間，這一結(jié)果表明熟制標本皮張和新鮮肌肉都能提取到純度較高的DNA.

將提取到的DNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,加10μL DNA原液,結(jié)果見圖1.由圖1可見，熟制標本皮張DNA含量非常少，而且有降解現(xiàn)象；新鮮肉DNA沒有降解.

將擴增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖2.5個樣品中共有4個樣品有擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物量少，條帶亮度遠低于新鮮肉擴增產(chǎn)物.

圖1 皮張DNA和新鮮肉DNA電泳結(jié)果 圖2 皮張DNA和新鮮肉DNA Cytb擴增結(jié)果

圖1中1為DL2000標準分子質(zhì)量標記，從上到下片段大小分別為2 000、1 000、750、500、250和100bp,每個條帶的DNA量為50 ng；2、3、4、5、9為熟制標本皮張總DNA；6、7、8為新鮮肌肉總DNA.

圖2中1為DL2000標準分子質(zhì)量標記，從上到下片段大小分別為2 000、1 000、750、500、250和100bp,每個條帶的DNA量為50 ng；2、3、4為肌肉mtDNACytb擴增結(jié)果；5、7、8、9、10為熟制標本皮張mtDNA擴增結(jié)果；6為空白對照.

對4份有條帶的PCR擴增產(chǎn)物測序，結(jié)果均為400bp.與NCBI上林麝Cytb序列(GI:4 587 194)對比同源性為99%，說明使用所提取出的DNA作模板時, PCR擴增并不受到微生物DNA的影響.

紫外吸收值測DNA濃度時發(fā)現(xiàn)新鮮肌肉和熟制標本皮張的OD值差不多，但擴增和電泳結(jié)果表明熟制標本皮張DNA含量明顯低于新鮮肌肉.由于熟制皮張核DNA多數(shù)已經(jīng)流失、降解，而且提取過程中雜質(zhì)不易清除，所以影響紫外吸收值.因此，標本皮張DNA濃度不易用紫外吸收值來測定.

DNA-膠原蛋白形成的是交聯(lián)復合物[5]，熟制的皮張仍含有少量的DNA[6，7]，由于熟制的皮張含的DNA少，提高膠原蛋白的消化效果，把真皮成分膠原纖維徹底消化掉，才能將DNA釋放出來；在皮張預處理時，盡可能減成小塊，使其能夠消化完全.用Promega裂解液能夠很好地將皮張消化完全.

圖2中10號樣品采集的是林麝腹部較軟的皮子，沒有能提取到DNA，也沒有得到擴增產(chǎn)物，這可能是由于皮張在熟制過程中有酸浸和刮削等工藝[8]，酸浸液會使皮膚中含有的成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞、血細胞、淋巴細胞、毛囊及其附屬腺體的細胞等細胞遭到破壞[9]，使DNA溶出，并隨廢液流失；對皮板刮削會使處于真皮深層的毛囊遭到破壞，使DNA進一步丟失.通過以上的試驗說明，熟制標本皮張?zhí)崛NA時，不應采集腹部較軟的皮子，應采集四肢、指甲縫、表皮褶皺的地方，這些地方受到的酸浸液和刮削的影響比較少，容易保留較多的DNA.

由于陳舊標本經(jīng)過長期放置，核DNA 受到紫外線照射和每年定期的防蟲熏蒸以及其它環(huán)境因素影響，降解的程度嚴重，所以在進行總DNA電泳測試時，沒有得到明顯條帶.由圖1和圖2可見，雖然DNA降解很厲害，但仍然能特異性地擴增出mtDNA上的片段，這是由于mtDNA是環(huán)狀DNA，比核細胞DNA難降解[10].在DNA提取過程中發(fā)現(xiàn)，殘存于皮板中的水溶性重金屬離子、鞣劑等酶抑制劑難以從體系中去除，所以標本樣品用Na2HPO4溶液浸泡前處理，去除鉻離子是非常重要的；并在DNA提取最后選擇用DNA提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金屬離子和PCR抑制劑.

3 結(jié) 論

標本樣品用Na2HPO4溶液浸泡前處理，并在DNA提取最后選擇用DNA提取純化試劑盒(DNA IQTM系統(tǒng)Promega)進行二次提取，才能有效的去除大部分的水溶性重金屬離子和PCR抑制劑；標本林麝核DNA 受到紫外線照射和每年定期的防蟲熏蒸以及其它環(huán)境因素影響，降解的程度嚴重，但仍然能特異性地擴增出mtDNA上的片段；熟制林麝標本皮張和新鮮肌肉都能提取到純度較高的DNA，紫外吸收值測DNA濃度的OD值差不多，但擴增和電泳結(jié)果表明熟制林麝標本皮張DNA含量明顯低于新鮮肌肉.

參考文獻

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