流動(dòng)相pH值對(duì)地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖HPLC色譜行為的影響*

王蔚昕，張春水，黃 星

（公安部物證鑒定中心，北京 100038）

地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖屬于苯二氮卓類藥物，具備抗焦慮、催眠、抗痙攣等廣泛卓越的藥理特性和良好的安全性，但同時(shí)長(zhǎng)期服用此類藥物也會(huì)產(chǎn)生依賴性，導(dǎo)致該類藥物的濫用現(xiàn)象[1]。地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖都為我國(guó)精神藥品品種目錄收載藥品，受國(guó)家管制，但截至目前，在法庭科學(xué)領(lǐng)域還缺乏對(duì)4種藥物高效液相分析方法的系統(tǒng)研究。本實(shí)驗(yàn)綜合考察了流動(dòng)相PH值對(duì)苯二氮卓類藥物HPLC色譜行為的影響，以期通過(guò)基礎(chǔ)性數(shù)據(jù)的積累，為苯二氮卓類藥物高效液相方法的開(kāi)發(fā)提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

地西泮、艾司唑侖、三唑侖、氯氮卓標(biāo)準(zhǔn)品；0.1M磷酸緩沖液（H3PO4、NaH2PO4、Na2HPO4）；乙腈。

1.2 主要儀器及實(shí)驗(yàn)條件

日本島津LC20AD液相色譜儀；SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器；CTO-20A柱溫箱；SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器；LCsolution高效液相色譜管理系統(tǒng)。

色譜柱為 inertsil ODS-SP 5μ4.6×150mm（pH適用范圍為PH2～7.5），柱溫為40℃，流動(dòng)相組成：有機(jī)相為乙腈、水相為0.1M磷酸緩沖液，洗脫程序?yàn)橛袡C(jī)相、水相比例由25∶75經(jīng)20min梯度洗脫至45∶55，并在此比例上維持 5min，流速 1.0mL·min-1，進(jìn)樣量1μL，舒樂(lè)安定、三唑侖檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，安定檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，氯氮卓檢測(cè)波長(zhǎng)為265nm。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 稱取地西泮、艾司唑侖、三唑侖、氯氮卓標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各適量，分別放入10mL容量瓶中，加入5mL甲醇振蕩溶解后，用甲醇稀釋至刻度，配制成約1.0mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 緩沖溶液的配制

表1 緩沖溶液的配制Tab.1 Preparation of buffer solution

1.3.3 分析過(guò)程 分別以不同pH值0.1M磷酸緩沖液作為流動(dòng)相的水相，取上述標(biāo)準(zhǔn)溶液在上述實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)樣分析，考察保留時(shí)間、拖尾因子、峰面積3個(gè)指標(biāo)（每個(gè)樣品相同條件下重復(fù)進(jìn)樣3次，各指標(biāo)取平均值）。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 對(duì)地西泮各指標(biāo)考察結(jié)果Tab.2 Index test result of Diazepam

表3 對(duì)艾司唑侖各指標(biāo)考察結(jié)果Tab.3 Index test result of Estazolam

表4 對(duì)氯氮卓各指標(biāo)考察結(jié)果Tab.4 Index test result of Chlordiazepoxide

表5 對(duì)三唑侖各指標(biāo)考察結(jié)果Tab.5 Index test result of Triazolam

2.2 討論與分析

圖1 地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖保留時(shí)間隨流動(dòng)相水相pH值的變化Fig.1 Curve of pH-retention time

圖2 地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖拖尾因子隨流動(dòng)相水相pH值的變化Fig.2 Curve of pH-tailing factor

圖3 地西泮、艾司唑侖、氯氮卓、三唑侖峰面積隨流動(dòng)相水相pH值的變化Fig.3 Curve of pH-peak area

2.2.1 流動(dòng)相pH值對(duì)地西泮、艾司唑侖、三唑侖、氯氮卓保留行為的影響 根據(jù)幾種苯二氮卓類藥物流動(dòng)相pH值-HPLC保留時(shí)間變化曲線圖推測(cè)，地西泮、艾司唑侖的pKa∈〔0.7，4.1〕；氯氮卓的pKa∈〔3.7，4.5〕；對(duì)于三唑侖，pKa≤0.7 或 pKa≥7.9。

在進(jìn)一步建立液相方法時(shí)，如果需要通過(guò)調(diào)整譜峰間距改善分離度，在考慮色譜柱pH值適用范圍的基礎(chǔ)上，對(duì)于地西泮、艾司唑侖，流動(dòng)相水相pH值應(yīng)限定在pH值為2～3的范圍內(nèi)進(jìn)行變化；對(duì)于氯氮卓，pH值可以在pH值為3～5的范圍內(nèi)進(jìn)行變化；對(duì)于三唑侖，pH值在pH值為2～6的范圍內(nèi)進(jìn)行變化對(duì)其保留時(shí)間基本無(wú)影響。

如果需要減小流動(dòng)相pH值對(duì)保留行為的影響，保證方法的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性，在考慮色譜柱pH值適用范圍的基礎(chǔ)上，對(duì)于地西泮、艾司唑侖，流動(dòng)相水相pH值應(yīng)控制在5～7的范圍；對(duì)于氯氮卓，pH值可控制在6～7或2～2.2的范圍，在低pH值端其保留時(shí)間較高pH值端明顯縮短，但低pH值端pH值穩(wěn)定范圍過(guò)窄，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮保留時(shí)間及操作穩(wěn)定性兩個(gè)因素，選擇合適pH值范圍；pH值在2～7的范圍內(nèi)，三唑侖的保留行為都較為穩(wěn)定。

2.2.2 流動(dòng)相pH值對(duì)地西泮、艾司唑侖、三唑侖、氯氮卓峰形的影響 流動(dòng)相水相pH值控制在2.2～6.4的范圍內(nèi)，地西泮、艾司唑侖、三唑侖都能得到較好峰形，且其拖尾因子值基本不隨pH值的改變而變化。

流動(dòng)相pH值的改變對(duì)氯氮卓的峰形影響較大，在pH值小于3.2時(shí)，氯氮卓成分峰形較差；pH值控制在3.2～6.4的范圍內(nèi)，氯氮卓也可得到較好峰形，且拖尾因子值基本穩(wěn)定。峰形不好可能導(dǎo)致理論塔板數(shù)測(cè)定不準(zhǔn)確，分離度降低，定量不準(zhǔn)確[2]。因此，氯氮卓HPLC定量分析方法的開(kāi)發(fā)不適合在流動(dòng)相水相pH值2～3的范圍內(nèi)進(jìn)行。

2.2.3 流動(dòng)相pH值對(duì)地西泮、艾司唑侖、三唑侖、氯氮卓DAD檢測(cè)器響應(yīng)值的影響 在流動(dòng)相水相pH值為2.2～3.2的范圍內(nèi)，地西泮、艾司唑侖、氯氮卓的單位響應(yīng)值隨pH值增大而增大，氯氮卓單位響應(yīng)值變化尤為明顯；在流動(dòng)相水相pH值為5.6～6.4的范圍內(nèi)，地西泮、艾司唑侖、氯氮卓的單位響應(yīng)值基本不隨pH值的改變而變化，穩(wěn)定保持在較高值。

在流動(dòng)相水相pH值為2.2～6.4的范圍內(nèi)，三唑侖的單位響應(yīng)值不隨pH值的改變而變化，保持穩(wěn)定。

待檢藥物單位響應(yīng)值的高低對(duì)其檢測(cè)限有較大影響，且其單位響應(yīng)值的穩(wěn)定性也顯著影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的長(zhǎng)期可比性。為了降低苯二氮卓類藥物的檢測(cè)限，提高檢測(cè)數(shù)據(jù)長(zhǎng)期可比性，苯二氮卓類藥物HPLC分析方法應(yīng)該在流動(dòng)相水相pH值為5～7的范圍內(nèi)進(jìn)一步開(kāi)發(fā)。

［1］童振華,徐嗣蓀.苯二氮卓類藥物依賴［J］.中國(guó)民政醫(yī)學(xué)雜志,1995,7（5）:298-300.

［2］L.R.森德?tīng)?J.J.柯克蘭,J.L.格萊吉克.實(shí)用高效液相色譜法的建立［M］.北京：華文出版社,2001.221-222.