單旭東 梁 鑫 漆 著 黃明孔

成都中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院,四川生殖衛(wèi)生學(xué)院(610041)

如何選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植從而獲得較高的妊娠率是人類輔助生殖技術(shù)(ART)的重要部分。一般選擇移植胚胎的方法是在胚胎發(fā)育的不同階段根據(jù)胚胎的外部形態(tài)對(duì)其評(píng)分從而得到相對(duì)優(yōu)質(zhì)的胚胎。由于 ART獲得的胚胎有高達(dá) 50%可能存在遺傳學(xué)缺陷[1],現(xiàn)在越來越多的生殖中心嘗試通過囊胚移植的方法存優(yōu)去劣。但囊胚培養(yǎng)的效率低,且存在無囊胚可移植的風(fēng)險(xiǎn),并不能應(yīng)用于所有患者。更多的生殖中心仍然選擇在第 3天(D3),甚至第 2天(D2)進(jìn)行胚胎移植,這就要求在胚胎發(fā)育的更早期階段對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià),選擇優(yōu)質(zhì)可移植的胚胎。對(duì)胚胎早期卵裂情況進(jìn)行觀察早在 2001年即被認(rèn)為是選擇D3移植胚胎的有效方法[2],Fisch等[3]在 2003年提出了改進(jìn)的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)(GES),首次將早期卵裂的觀察方法系統(tǒng)地應(yīng)用于胚胎評(píng)分中,以此預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛力,在 D3選擇出最優(yōu)秀的胚胎進(jìn)行移植,并得到了較好的結(jié)果。本研究的主要目的在于探討觀察胚胎早期卵裂情況是否能夠有效指導(dǎo)臨床,得到較高的妊娠率。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

2008年 12月 29日 ～2010年 1月 1日在本中心進(jìn)行體外受精 -胚胎移植(IVF-ET)/卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)治療的 117個(gè)周期,女方年齡 32.1±5.5歲。

1.2 方法

1.2.1 促排卵、受精與胚胎觀察 采用經(jīng)典長(zhǎng)方案促排卵,月經(jīng)第 21天注射達(dá)必佳 0.1mg/d,至下次月經(jīng)第 3天根據(jù)卵泡情況注射促性腺激素(Gn),當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡達(dá)到 18mm時(shí)注射人絨毛膜促性腺激素(hCG),注射后 34～37h取卵,取卵后 3～6h受精。精子密度為(0.1～0.5)×106/m l。胚胎采用微滴培養(yǎng)法,在37℃,5.5%CO2,92%～95%濕度狀況下培養(yǎng)至 D3。受精后 17～19h觀察原核(PN),23～27h觀察早期卵裂(ICSI周期一般在 23～26h,IVF周期在 24～27h),41～42h觀察 D2胚胎發(fā)育情況,65～67h觀察D3胚胎發(fā)育情況。

1.2.2 胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分 按照胚胎形態(tài)學(xué)對(duì)胚胎進(jìn)行評(píng)分,包括卵裂球數(shù)目、大小、形狀、碎片和透明帶的厚度及完整性等。胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下[4,5]：①4分,細(xì)胞大小均勻且形狀規(guī)則,透明帶完整,胞質(zhì)均勻清晰,無顆粒現(xiàn)象,碎片 ＜5%;②3分,細(xì)胞大小略不均勻,形狀略不規(guī)則,胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象,碎片10%～20%;③2分,細(xì)胞大小明顯不均勻,可有形狀明顯不規(guī)則,胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象,碎片 21%～50%;④1分,細(xì)胞大小嚴(yán)重不均,胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆?，F(xiàn)象,碎片 ＞50%。

1.2.3 優(yōu)質(zhì)胚胎選擇與移植 對(duì)進(jìn)行了早期卵裂觀察的正常受精胚胎(17～19h觀察 PN為 2的胚胎)進(jìn)行分析。D2優(yōu)胚以當(dāng)天卵裂球數(shù)為 4,評(píng)分≥3為標(biāo)準(zhǔn);D3優(yōu)胚以當(dāng)天卵裂球數(shù) 7～9,評(píng)分≥3為標(biāo)準(zhǔn)[3]。D3結(jié)合胚胎發(fā)育和評(píng)分情況選擇優(yōu)質(zhì)的胚胎進(jìn)行移植,移植周期患者 hCG日子宮內(nèi)膜厚度均 ＞8mm。移植后 14d通過血 hCG確定生化妊娠,移植后 28d通過 B超確定宮內(nèi)孕囊,可見胎芽及胎心診斷為臨床妊娠。

1.2.4 胚胎分組評(píng)價(jià) ①按照胚胎的早期卵裂情況,將正常受精胚胎分為 4組,分別為早期卵裂組、未早期卵裂組、PN未消失組和其它胚胎組(包括 23～27h時(shí)表現(xiàn)為 1PN或碎片化的胚胎),對(duì)各組的 D2、D3優(yōu)胚率分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì);②根據(jù)移植胚胎的早期卵裂情況將移植周期分為 4組：全部移植早期卵裂胚胎組、全部移植未早期卵裂胚胎組、全部移植 PN未消失胚胎組和混合組,對(duì) 4組的生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率以及前 3組中完全移植優(yōu)胚周期的臨床妊娠率(以下簡(jiǎn)稱優(yōu)胚臨床妊娠率,即完全移植優(yōu)胚周期妊娠數(shù)/完全移植優(yōu)胚周期數(shù) ×100%)和完全移植優(yōu)胚周期種植率(以下簡(jiǎn)稱優(yōu)胚種植率,即完全移植優(yōu)胚周期種植胚胎數(shù)/完全移植優(yōu)胚周期移植胚胎數(shù)×100%)等指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì);③根據(jù) D3時(shí)移植胚胎中含有優(yōu)胚的數(shù)目,將移植周期分為：移植 2～3個(gè)優(yōu)胚組,移植 1個(gè)優(yōu)胚和 1～2個(gè)非優(yōu)胚組以及未移植優(yōu)胚組,比較這 3組周期的妊娠率和種植率等。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用 SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,樣本陽性率的比較采用 χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 早期卵裂胚胎與優(yōu)胚率

正常受精胚胎的 D2、D3優(yōu)胚率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 1。

表 1 早期卵裂與優(yōu)胚率關(guān)系(%)

早期卵裂組和未早期卵裂組的 D2、D3優(yōu)胚率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),但與 PN未消失組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。在早期卵裂組中,早期卵裂數(shù)目為 2且評(píng)分≥3的胚胎的 D3優(yōu)胚率最高,為 73.9%;而早期卵裂數(shù)目≥3或評(píng)分 ＜3的胚胎 D2、D3優(yōu)胚率較低,其 D3優(yōu)胚率分別為 27.3%和 33.3%。另外,年齡 ＜35歲和≥35歲患者的胚胎早期卵裂率分別為 26.4%(193/732)和 26.5%(43/162),兩者間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2 早期卵裂與妊娠率

在進(jìn)行了早期卵裂觀察的 117個(gè)周期中,共 102個(gè)周期在 D3進(jìn)行了鮮胚移植,生化妊娠 53個(gè)周期,臨床妊娠 43個(gè)周期,移植周期生化妊娠率(52.0%)大于同期未進(jìn)行早期卵裂觀察的移植周期生化妊娠率(43.5%)。102個(gè)周期共移植 220個(gè)胚胎,其中早期卵裂胚胎 79個(gè),未早期卵裂胚胎 63個(gè),PN未消失胚胎 78個(gè)。根據(jù)移植胚胎的早期卵裂情況將移植周期分組統(tǒng)計(jì),結(jié)果見表 2。

表 2 早期卵裂情況與妊娠率的關(guān)系

4組患者年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。全部移植早期卵裂胚胎組的生化妊娠率高于另外 3組(P＜0.05),但 4組間臨床妊娠率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。全部移植未早期卵裂胚胎組的種植率高于全部移植早期卵裂胚胎組和全部移植 PN未消失胚胎組(P＜0.05),但與混合組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。全部移植早期卵裂胚胎組優(yōu)胚種植率顯著低于全部移植未早期卵裂胚胎組和全部移植 PN未消失胚胎組(P＜0.05)。全部移植 PN未消失組的優(yōu)胚臨床妊娠率顯著高于全部移植早期卵裂組和全部移植未早期卵裂組(P＜0.05)。

2.3 優(yōu)胚率與妊娠率

根據(jù)移植周期的優(yōu)胚情況分組統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表 3。移植胚胎中含有優(yōu)胚的兩組生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率均顯著高于不含優(yōu)胚組(P＜0.05)。

3 討論

對(duì)胚胎早期卵裂的觀察可以有效預(yù)見胚胎的發(fā)育潛力,對(duì)優(yōu)質(zhì)胚胎的選擇具有重要意義[6]。早期卵裂結(jié)合 PN評(píng)分或 D2四細(xì)胞單核的觀察以及囊胚的評(píng)分等方法已有所研究[3,7],多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為早期卵裂的胚胎能夠得到較高的優(yōu)胚率或囊胚形成率[2,3],從而可以提高移植的妊娠率。一些報(bào)道進(jìn)行了更細(xì)致的研究,將早期卵裂的情況進(jìn)行了分類和評(píng)分,認(rèn)為只有卵裂時(shí)形態(tài)正常、碎片少,卵裂數(shù)目為 2的胚胎才能得到好的結(jié)果[2,3,6,8]。本研究中,24～28h實(shí)現(xiàn)了早期卵裂的胚胎在 D3的優(yōu)胚率顯著高于未早期卵裂胚胎和 PN未消失胚胎,但早期卵裂數(shù)目≥3或評(píng)分 ＜3的胚胎優(yōu)胚率顯著低于卵裂球數(shù)為 2且評(píng)分 ＞3的胚胎,這與上述觀點(diǎn)中早期卵裂可以得到較高優(yōu)胚率的看法基本相同。

表 3 優(yōu)胚與妊娠率的關(guān)系

另有報(bào)道認(rèn)為早期卵裂僅能預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛力,與妊娠結(jié)局關(guān)系不大[9]。從本文結(jié)果看,早期卵裂的形成與患者年齡無關(guān),患者年齡的差異并不能通過早期卵裂的形成影響妊娠率?？偨Y(jié)本研究中早期卵裂與妊娠率、種植率的關(guān)系后,筆者發(fā)現(xiàn)早期卵裂組與未早期卵裂組以及 PN未消失組的生化妊娠率存在差異,但臨床妊娠率無差異。僅就 D3優(yōu)質(zhì)胚胎而言,PN未消失組的臨床妊娠率和種植率等指標(biāo)反而好于其它周期,單獨(dú)觀察優(yōu)胚移植周期,早期卵裂組優(yōu)胚的種植率也顯著低于 PN未消失組和未早期卵裂組,而移植了優(yōu)胚的周期,無論在生化妊娠率、臨床妊娠率和種植率上都遠(yuǎn)優(yōu)于未移植優(yōu)胚的周期。可以看出,臨床妊娠率與種植率的高低更多取決于優(yōu)胚而非早期卵裂情況。

分析研究結(jié)果,筆者認(rèn)為通過觀察胚胎早期卵裂的方法可以預(yù)測(cè)胚胎的發(fā)育潛能,有效預(yù)測(cè)優(yōu)胚率,移植優(yōu)質(zhì)的早期卵裂胚胎可以提高生化妊娠率,但對(duì)臨床妊娠率和種植率的影響不大,決定臨床妊娠率和種植率的最具實(shí)際意義的指標(biāo)仍然是優(yōu)質(zhì)胚胎。筆者認(rèn)同對(duì)胚胎早期卵裂觀察的方法對(duì)于 D2進(jìn)行移植的周期具有一定的意義[10],對(duì) D3及之后的胚胎移植僅起輔助作用,不能單獨(dú)應(yīng)用。本文中 PN未消失組的胚胎一旦發(fā)育為優(yōu)胚則具有較高的妊娠率,這可能與胚胎發(fā)育中的補(bǔ)償機(jī)制有關(guān),確切原因還需進(jìn)一步研究。

1 Gianaroli L,Magli MC,Ferraretti AP,et al.Preimplantation genetic diagnosis increases the implantation rate in human in vitro fertilization by avoiding the transfer of chromosomally abnormal embryos[J].Fertil Steril,1997,68：1128-1131.

2 Fisch JD,Rodriguez H,Ross R,et al.The Graduated Embryo Score(GES)predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage-stage embryos[J].Hum Reprod,2001,16：1970-1975.

3 Fisch JD,Sher G,Adamoviczm,et al.The graduated embryo score predicts the outcome of assisted reproductive technologiesbetter than a single day 3 evaluation and achieves results associated with blastocyst transfer from day 3 embryo transfer[J].Fertil Steril,2003,80：1352-1358.

4 陳子江.人類生殖與輔助生殖[M].北京：科學(xué)出版社,2005：430.

5 莊廣倫.現(xiàn)代輔助生殖技術(shù)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社,2005：240-241.

6 Ciray HN,Karagenc L,Ulug U,et al.Early cleavagemorphology affects the quality and implantation potentialof day 3 embryos[J].Fertil Steril,2006,85：358-365.

7 Sundstrom P.Early embryo cleavageand day 2mononucleation after intracytoplasmatic sperm injection for predicting embryo implantation potential in single embryo transfer cycles[J].Fertility and Sterility,2008,89,(2)：475-477.

8 Hardarson T,Hanson C,Sj?gren A,et al.Human embryos with unevenly sized blastomereshave lower pregnancy and implantationrates：indications for aneuploidy and multinuc leation[J].Hum Reprod,2001,16：313-318.

9 Summers-Chase D,Horwath D,Yuan W,et al.Pregnancy rates with and without transferring embryos,which showed early cleavage[J].Fertil Steril,2004,82(Suppl 2)：220.

10 Holte J,Berglund L,Milton K,et al.Construction of an evidencebased integrated morphology cleavage embryo score for implantation potential of embryos scored and transferred on day 2 after oocyte retrieval[J].Human Reprod,2007,22：548-557.