李澎濤，王娜，郭戰(zhàn)坤，殷晨星，孟娜娜，師楠，于曉光，李克用，王玉真

(保定市婦幼保健院生殖中心，保定 071000)

隨著囊胚培養(yǎng)技術及玻璃化冷凍技術的發(fā)展，囊胚移植得以實現(xiàn)并廣泛應用于臨床。在囊胚培養(yǎng)的過程中發(fā)育潛能差或染色體異常的胚胎被淘汰，而且囊胚與子宮內膜發(fā)育階段同步，因此囊胚移植具有更高的臨床妊娠率、著床率，為單囊胚移植成為現(xiàn)實打下了基礎，而單囊胚移植可顯著降低多胎率，以緩解因多胎造成的各種風險[1-2]。影響囊胚形成及囊胚發(fā)育潛能的因素眾多，例如患者年齡、原核期胚胎質量、卵裂期胚胎質量、培養(yǎng)環(huán)境等[3-5]，本研究探討非優(yōu)質D3剩余卵裂胚質量對繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響，從而為臨床選擇更具有發(fā)育潛能的胚胎提供參考。

一、資料與方法

1.研究對象：2017年2月至2019年10月在保定市婦幼保健院生殖醫(yī)學科接受IVF-ET治療后非優(yōu)質D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET周期及同期優(yōu)質D3卵裂胚FET周期的患者。

納入標準：(1)IVF-ET周期患者采用常規(guī)長方案控制性促排卵；(2)女方年齡24～34歲；(3)女方體重指數(shù)(BMI)18～25 kg/m2；(4)雙方均無遺傳性疾??；(5)復蘇周期采用人工周期內膜準備方案；(6)優(yōu)質D3卵裂胚FET周期或非優(yōu)質D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET周期。

排除標準：(1)血抗苗勒管激素(AMH)≤1.1 ng/ml、竇卵泡數(shù)(AFC)<6的卵巢功能減退患者；(2)子宮內膜異位癥患者。

2.非優(yōu)質D3剩余卵裂胚繼續(xù)培養(yǎng)/冷凍及FET周期：納入本研究的所有FET周期患者IVF-ET周期均采用常規(guī)長方案控制性促排卵，于HCG注射36 h后經(jīng)陰道超聲引導下取卵。利用G-seriesTM培養(yǎng)液培養(yǎng)胚胎至D3，依據(jù)ASEBIR卵裂期胚胎評價標準[6]對胚胎進行評價，根據(jù)細胞數(shù)、碎片率、均一度、多核/空泡表現(xiàn)及透明帶狀況等，將D3卵裂胚分為I～IV級，評級為Ⅰ級為優(yōu)質卵裂胚；移植或冷凍后剩余非優(yōu)質D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5/D6，依據(jù)Gardner囊胚分級法[7]對形成的囊胚進行評價，選擇3期及以上且滋養(yǎng)層或內細胞團評級不同時為C的囊胚冷凍保存。

卵裂胚及囊胚的冷凍和解凍均使用日本Kitazato公司的冷凍及解凍套裝。囊胚冷凍前均進行激光打孔皺縮。按照試劑說明書對胚胎進行冷凍及復蘇，復蘇后對卵裂胚透明帶進行削薄、3/4期囊胚進行激光輔助孵化。

胚胎復蘇后，在37℃、6%CO2培養(yǎng)箱內繼續(xù)培養(yǎng)2 h后觀察并記錄解凍胚胎細胞的存活細胞數(shù)、壞死細胞數(shù)及繼續(xù)培養(yǎng)后的生長情況。復蘇后3～4 h，用移植管連接BD1 ml氣密注射器，一段式裝管后，B超引導下將胚胎移植入子宮腔中后部。解凍D3優(yōu)質卵裂胚移植1～2枚，囊胚擇優(yōu)行單囊胚移植。胚胎移植后35 d腹部B超觀察到宮腔內孕囊及心管搏動為臨床妊娠。

3.研究分組：依據(jù)繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的非優(yōu)質D3剩余卵裂胚質量分為A組(Ⅱ級D3剩余卵裂胚組)、B組(Ⅲ級D3剩余卵裂胚組)、C組(Ⅳ級D3剩余卵裂胚組)，所形成的囊胚FET周期依次為A1、B1、C1組。另以優(yōu)質D3卵裂胚(I級)FET周期為移植結局對照組(D組)。

4.觀察指標及判定標準：囊胚形成率=D5/D6形成的2期以上囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；優(yōu)質囊胚形成率=D5/D6形成的優(yōu)質囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；可利用囊胚形成率=D5/D6形成的可利用囊胚數(shù)/繼續(xù)培養(yǎng)胚胎數(shù)×100%；臨床妊娠率=超聲下能檢測到孕囊的妊娠周期數(shù)/移植周期數(shù)×100%；著床率=超聲下檢測到的孕囊數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%；早期流產(chǎn)率=孕周<12周的流產(chǎn)周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%；異位妊娠率=異位妊娠周期數(shù)/臨床妊娠周期數(shù)×100%。

二、結果

1.D3剩余胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結局：繼續(xù)培養(yǎng)的非優(yōu)質D3剩余卵裂胚共3 015枚，其中Ⅱ級D3剩余卵裂胚515枚、Ⅲ級D3剩余卵裂胚1 664枚、Ⅳ級D3剩余卵裂胚836枚；共形成囊胚1 317枚，其中可利用囊胚963枚、優(yōu)質囊胚474枚。

隨著D3剩余卵裂胚質量下降，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)卵裂胚的囊胚形成率、D5/D6可利用囊胚形成率、優(yōu)質囊胚形成率均顯著下降(P<0.01)(表1)。

表1 D3剩余胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)結局比較[n(%)]

2.FET周期臨床結局：本研究比較了不同質量的非優(yōu)質D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)所形成囊胚的單囊胚FET結局，共264個單囊胚FET周期，其中A1組116周期、B1組82周期、C1組66周期。并且與同期D3優(yōu)質卵裂胚FET的79周期(D組)進行比較。

患者基本情況：各組間患者年齡、不孕年限、BMI、既往周期數(shù)、基礎FSH值和移植日子宮內膜厚度等比較，均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 FET周期各組患者基本情況比較(-±s)

臨床結局：C1組移植D5囊胚比例顯著低于A1、B1組(P<0.05)，臨床妊娠率亦顯著低于A1、B1組(P<0.05)；A1、B1組著床率顯著高于C1、D組(P<0.05)；C1組活產(chǎn)率顯著低于A1組(P<0.05)。早期流產(chǎn)率、異位妊娠率各組間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(表3)。

表3 FET周期各組患者妊娠結局的比較(%)

三、討論

囊胚培養(yǎng)越過了胚胎基因組激活階段，一些發(fā)育潛能差及染色體異常的胚胎在囊胚培養(yǎng)過程中被淘汰，從而提高了移植周期臨床妊娠率及胚胎著床率[7]，并且囊胚比卵裂期胚胎冷凍效果更好[8]。隨著囊胚培養(yǎng)及玻璃化冷凍技術在輔助生殖領域的發(fā)展，囊胚冷凍、囊胚移植在很多生殖中心得到廣泛應用。盡管囊胚移植具有以上眾多優(yōu)勢，但影響囊胚形成及其移植結局的因素眾多，本文主要就非優(yōu)質D3剩余卵裂胚質量對繼續(xù)囊胚培養(yǎng)卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響進行了探討分析。

章志琴等[3]對D3剩余胚胎囊胚培養(yǎng)，采用Logistic逐步回歸法對影響優(yōu)質囊胚形成率的相關因素進行了分析，該研究認為D2卵裂球數(shù)4個的胚胎繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的優(yōu)質囊胚形成率顯著高于少于卵裂球數(shù)4個的胚胎，隨著D3卵裂球數(shù)的增多，優(yōu)質囊胚形成率也隨之升高，但8個卵裂球的胚胎的優(yōu)質囊胚形成率優(yōu)于9～10個卵裂球的胚胎；胚胎碎片、空泡及多核對優(yōu)質囊胚的形成有負面影響。Kong等[9]利用Time-Lapse研究了細胞數(shù)、細胞破碎、卵裂方式與胚胎發(fā)育潛能之間的關系，發(fā)現(xiàn)細胞破碎的發(fā)生會導致D3細胞數(shù)數(shù)目減少，但在≥7細胞的胚胎中細胞碎片的發(fā)生率明顯減少，囊胚形成率及優(yōu)質囊胚形成率隨著細胞數(shù)的增加而增加，但7～8細胞時囊胚形成率及優(yōu)質囊胚形成率是所有分組中最高的；胚胎卵裂方式亦是影響胚胎發(fā)育潛能的一個重要因素，那些非平衡性卵裂即一個卵裂球直接分裂成3個或者更多細胞的胚胎，當卵裂細胞數(shù)≥5細胞時，胚胎發(fā)育潛能明顯降低。在細胞數(shù)5～6細胞時，相較于細胞碎片非平衡性卵裂對囊胚的形成影響更大，但在7～8細胞大多表現(xiàn)正常卵裂，雖然非平衡性卵裂也降低了胚胎發(fā)育潛能，但它們之間的比較無統(tǒng)計學差異。胚胎的發(fā)育與胚胎的非整倍體率密切相關，胚胎的非整倍體率影響胚胎發(fā)育速度、內細胞及滋養(yǎng)層形態(tài)[10]，施文浩等[11]對D3卵裂期胚胎進行PGS分析發(fā)現(xiàn)，卵裂期胚胎評價參數(shù)中胚胎的碎片體積比例低的胚胎整倍體率較高。本研究依據(jù)ASEBIR卵裂期胚胎評價標準綜合了D3卵裂胚細胞數(shù)、碎片率、均一度、多核/空泡表現(xiàn)及透明帶狀況等對胚胎評級，不同質量非優(yōu)質D3卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)，得出與以上等研究相似的結果，即隨著D3剩余卵裂胚質量的降低，繼續(xù)囊胚培養(yǎng)的囊胚形成率、D5/6可利用囊胚形成率、優(yōu)質囊胚形成率亦顯著下降。

那么這些非優(yōu)質D3剩余卵裂胚形成的囊胚發(fā)育潛能如何呢？Urman等[12]認為D3胚胎質量雖然影響囊胚形成率，但對所形成的囊胚質量及其發(fā)育潛能沒有關系。但Kong等[9]的研究發(fā)現(xiàn)≥7細胞的卵裂期胚胎，整倍體率高，發(fā)育速度較之細胞數(shù)<7的胚胎要快一些，D5形成的囊胚比例高于后者，而移植D5囊胚的臨床結局明顯優(yōu)于D6囊胚[13-14]，這與本研究中FET周期由于Ⅱ/Ⅲ級D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例高于Ⅳ級D3剩余卵裂胚形成的D5囊胚移植比例，導致前者的妊娠結局優(yōu)于后者的情況相符。在郭映純等[15]的研究中認為非優(yōu)質卵裂期胚胎即使形成囊胚移植后的妊娠結局并不樂觀，而在本研究中Ⅲ級D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET仍能獲得較好的妊娠結局，分析其原因是由于兩個研究所采用的卵裂期評分標準不一樣，本研究評分結合了D2和D3胚胎卵裂球數(shù)的發(fā)育速度均衡性，導致整體胚胎評分較低，Ⅲ/Ⅳ級胚胎比例偏高，造成了兩份研究結論的偏差。

在本研究中Ⅳ級D3剩余卵裂胚形成囊胚的單囊胚FET活產(chǎn)率顯著低于Ⅱ級D3剩余卵裂胚形成的囊胚，分析其原因可能是即使胚胎發(fā)育至囊胚仍有36%非整倍體率發(fā)生，低質量卵裂期胚胎所形成囊胚的非整倍體發(fā)生率高于高質量卵裂期胚胎所形成的囊胚[16]，導致即使形成了囊胚，其發(fā)育潛能亦會較差。

本研究中Ⅱ/Ⅲ級D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET著床率顯著高于優(yōu)質D3卵裂胚FET著床率，此結果與鄒敏等[17]的研究一致，其研究認為D3剩余卵裂胚繼續(xù)囊胚培養(yǎng)至D5形成的囊胚FET周期臨床妊娠率、著床率顯著高于優(yōu)質D3卵裂胚及D6形成的囊胚FET周期的臨床妊娠率、著床率，而優(yōu)質D3卵裂胚與D6形成的囊胚的FET周期妊娠率、著床率無統(tǒng)計學差異。

綜上所述，剩余D3卵裂胚質量對囊胚的形成及其發(fā)育潛能有著一定的預測價值，在以往的大多文章中就影響囊胚形成的獨立因素如年齡、卵裂球數(shù)量、碎片比例、均一程度等分別進行了研究，本研究將患者年齡限制在24～34歲，排除了年齡因素的干擾，同時將卵裂球數(shù)量、碎片比例等因素綜合起來評價卵裂期胚胎質量，從而分析D3剩余卵裂胚質量對卵裂胚的囊胚形成及其所形成囊胚發(fā)育潛能的影響，選擇出更具有發(fā)育潛能的囊胚。與優(yōu)質D3卵裂胚FET周期相比，Ⅱ/Ⅲ級D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET能夠獲得更高的著床率，即使Ⅳ級D3剩余卵裂胚所形成囊胚的單囊胚FET也能獲得與優(yōu)質D3卵裂胚FET相近的妊娠結局，因此優(yōu)先選擇移植評分高的D3剩余卵裂胚形成的囊胚移植，可以提高胚胎移植效率，同時減少了促排卵等相關操作，極大降低了對患者身心健康損害及患者醫(yī)療費用。