普洱茶樣中“金花”微生物的分離鑒定

馬 燕 趙 明 周 玲 袁文俠 劉議聰 董燕梅 周紅杰

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶學(xué)院·昆明·650201）

一般認(rèn)為“發(fā)花”是形成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的關(guān)鍵工藝，“發(fā)花”的實(shí)質(zhì)是通過控制一定的外界條件，促使微生物優(yōu)勢菌——冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的生長繁殖，產(chǎn)生金黃色的閉囊殼，俗稱“金花”[1]。散囊菌可能產(chǎn)生纖維素酶等胞外酶催化茶葉化合物的轉(zhuǎn)化，能夠改善茶葉的品質(zhì)，還可增加多種微生物代謝活性產(chǎn)物，豐富茶葉成分，增加保健功能，對茯磚品質(zhì)形成起著重要作用[2]。

部分普洱茶樣品也發(fā)現(xiàn)有金黃色的小斑點(diǎn)，類似“金花”（圖1）。在市場銷售過程中，有的茶商直接認(rèn)為金黃色的小斑點(diǎn)是與茯磚茶中相同的“金花”，而有的則認(rèn)為不是金花，甚至可能是黃曲霉，因此需要進(jìn)一步分離鑒定普洱茶中的這些微生物。本文對一個(gè)普洱茶樣中疑似“金花”的真菌微生物進(jìn)行了分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)茶樣

“金花”普洱茶：普洱茶銷售人員送檢的普洱緊壓茶，樣品中有金黃色的小斑點(diǎn)（圖1），近似茯磚的“金花”。

發(fā)花用茶磚：實(shí)驗(yàn)室自制的茶磚。

圖1 “金花”普洱茶樣品Figure 1 Pu-erh tea w ith“jinhua”

1.1.2 試劑

真菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒為上海華舜生物工程公司產(chǎn)品；Ex Taq酶和PCR相關(guān)試劑購自大連TaKaRa公司；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 茶樣微生物分離

茶樣微生物分離按國標(biāo)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)(GB 4789-2010)的方法進(jìn)行。

1.2.2 微生物鑒定

菌落形態(tài)，霉菌：PDA培養(yǎng)基，三點(diǎn)接種，28℃，培養(yǎng)7d。

顯微結(jié)構(gòu)，插片法與粘片法[3]。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

應(yīng)用真菌基因組DNA提取試劑盒(上海華舜生物工程公司產(chǎn)品)提取DNA，按說明書操作。應(yīng)用引物 ITS4 （5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）和ITS5（5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’）擴(kuò)增真菌核糖體RNA基因（即rDNA）的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal Transcribed Spacer,ITS）[4]，擴(kuò)整體系按 Ex Taq 酶說明書進(jìn)行。擴(kuò)增程序：95℃，5min；（95℃30s，50℃ 30s，72℃ 30s）×40 個(gè)循環(huán)；72℃，5min。擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海英俊生物工程技術(shù)有限公司測序。將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLASTn搜索同源序列，選取序列相近的2個(gè)GenBank收錄序列，用BioEdit軟件分析序列與GenBank收錄序列的相似性，鑒定菌株。

1.2.4 茶樣發(fā)花試驗(yàn)

PDA斜面28℃培養(yǎng)7～14d，至菌株長出孢子，以滅菌蒸餾水洗滌，制備孢子懸液，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，稀釋至104個(gè)/mL，每塊茶磚分別接種5mL菌液，30℃保濕培養(yǎng)，15d觀察茶磚是否長出“金花”。

2 結(jié)果

2.1 茶樣微生物分離

應(yīng)用國標(biāo)方法分離茶樣中微生物，經(jīng)平板劃線純化，根據(jù)菌落形態(tài)的差異共獲得4株真菌，分別編號(hào)01～04。

2.2 菌株的形態(tài)特征

各菌株經(jīng)PDA平板培養(yǎng)（7d），菌落形態(tài)見圖2，形態(tài)描述見表1；經(jīng)插片法或粘片法觀察，各菌落的顯微特征見圖3，顯微特征描述見表1。

表1 菌株01～04的菌落及顯微特征Table 1 The clone andm icroscopicmorphology ofstrain 01～04

圖2 菌株的菌落Figure 2 The clone ofstrain 01～04

圖3 菌株的顯微結(jié)構(gòu)Figure 3 Them icroscopicmorphology ofstrain 01～04

2.3 菌株的分子生物學(xué)鑒定

擴(kuò)增測序得到各菌株的ITS序列，Blastn比對分析，菌株01～04分別鑒定為塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）、傘枝犁頭霉 （Lichtheimia corymbifera）、阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）和黑附球菌 （Epicoccum nigrum）（表2）。將序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫獲得序列登記號(hào)分別為：HQ728255～HQ728258。

表2 菌株01～04的Blastn比對結(jié)果Table 2 The results of Blastn of strain 01～04

2.4 茶樣發(fā)花試驗(yàn)

茯磚茶中的“金花”主要是冠突散囊菌（Eurotium cristatum）的金黃色閉囊殼，試驗(yàn)從普洱茶樣中分離鑒定出1株阿姆斯特丹散囊菌，推測該菌產(chǎn)生的閉囊殼可能是該普洱茶樣中的“金花”。為了驗(yàn)證該推測，進(jìn)行了普洱茶“發(fā)花”試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，接種阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶出現(xiàn)了“金花”，與送檢“金花”普洱茶樣出現(xiàn)的黃色斑點(diǎn)相同（圖4）。

圖4 接種阿姆斯特丹散囊菌的普洱茶Figure 4 Pu-erh brick tea inoculated with Eurotium amstelodami.

3 討論

一般認(rèn)為冠突散囊菌是茯磚中的優(yōu)勢微生物，同時(shí)有些樣品存在其他散囊菌。王志剛等[5]從17份茯磚茶樣品中分離到冠突散囊菌、間型散囊菌、謝瓦散囊菌、匍匐散囊菌、散囊菌、赤散囊菌和一種散囊菌。散囊菌對茯磚茶的品質(zhì)風(fēng)味形成具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)從一普洱茶樣中檢出阿姆斯特丹散囊菌，感官審評該茶樣發(fā)現(xiàn)其茶湯紅潤、透明，有菌菇湯的滋味，推測阿姆斯特丹散囊菌可能增加了該普洱茶樣中某些氨基酸的含量。該“金花”普洱茶中氨基酸等化學(xué)成分含量的測定及比較有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)證實(shí)通過接種該阿姆斯特丹散囊菌可以使普洱茶產(chǎn)生“金花”，為特色普洱茶的生產(chǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 宛曉春.茶葉生物化學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2003.

2 劉子音,許愛清,李宗軍,等.茯磚茶中冠突散囊菌及其代謝產(chǎn)物研究進(jìn)展[J].茶葉通訊,2010,37(1):23～26.

3 黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,1999.

4 N L Glass,G C Donaldson.Development of Primer Sets Designed for Use with the PCR To Amplify Conserved Genes from Filamentous Ascomycetes.Applied And EnvironmentalMicrobiology,1995,61(4):1323～1330

5 王志剛,童哲,程蘇云.茯磚茶中散囊菌的種類組成和鑒定[J].茶葉科學(xué),1991,11(2):157～161.