豬繁殖候選基因HoxA10的克隆及表達分析

周曉寧，方梅霞，何小梅，聶慶華*，張細權(quán)

（1.華南農(nóng)業(yè)大學 動物科學學院，廣東 廣州 510642；2.廣東省農(nóng)業(yè)動物基因組學與分子育種重點實驗室，廣東廣州 510642；3.暨南大學 醫(yī)學院，廣東 廣州 510632）

HoxA10是同源框基因（HomeoBox,Hox） 亞類腹 B（AbdB）基因成員之一[1]，在生殖與胚胎著床、發(fā)育等方面有重要作用。HoxA10基因敲除小鼠的子宮輸卵管連接處消失，子宮近側(cè)25%部分呈輸卵管狀狹窄卷曲[2]。Satokata等[3]的研究證實了這一點，HoxA10（–/–） 小鼠可以存活，但由于子宮內(nèi)膜缺乏胚胎著床環(huán)境，子宮內(nèi)膜不能進入容受狀態(tài)，導致胚胎死亡，表現(xiàn)為不孕。雄性動物的研究也顯示出生殖障礙。Benson 等[4]發(fā)現(xiàn)，HoxA10（–/–） 突變雄鼠出現(xiàn)雙側(cè)隱睪和副性器官以及精子發(fā)育障礙等形態(tài)異常，可見，HoxA10基因在生殖器官的完整發(fā)育以及胚胎著床過程中有重要的調(diào)控作用，是動物繁殖性狀的重要候選基因。近年來，對HoxA基因的研究主要集中在對人和嚙齒類的研究中。人HoxA10基因定位于染色體7p15.3[2]。在成人子宮內(nèi)膜，HoxA10的表達依賴于月經(jīng)周期，是子宮蛻膜化過程的一個關鍵因素[5]。李紅等[6]發(fā)現(xiàn)，HoxA10基因在正常育齡婦女和不明原因不孕患者的增殖早、晚期及分泌早期，子宮內(nèi)膜腺上皮和間質(zhì)均有表達，相互之間無顯著差異，但在分泌中、晚期，正常育齡婦女子宮內(nèi)膜的腺體和間質(zhì)HoxA10基因mRNA有顯著高表達。關于嚙齒類的研究[2]表明，小鼠HoxA10基因定位于6號染色體。在小鼠胚胎發(fā)育過程中，HoxA10基因在苗勒管和成熟子宮內(nèi)膜中均有表達[7]。桂耀庭等[8]發(fā)現(xiàn)，在正常人和隱睪癥患者的睪丸組織中，HoxA10均有表達，但是與正常人相比，HoxA10基因在隱睪癥睪丸組織的表達顯著降低。HoxA10基因在生殖與胚胎著床、發(fā)育等方面有重要的作用， 對HoxA10基因的研究有利于了解豬的繁殖性狀，進而提高豬的繁殖性能。目前對豬HoxA10基因的研究較少[9]，對豬HoxA10基因的序列、結(jié)構(gòu)等相關信息都還缺乏研究。筆者在對豬HoxA10基因生物信息學進行分析的基礎上，用RT-PCR、Real-Time PCR等方法，研究該基因的克隆及表達，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

于廣東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所隨機選取120日齡長白母豬1頭，放血屠宰后，立即采集垂體、大腦、小腦，丘腦、卵巢、肺、胃、背肌、大腸、腹脂、肝、后肌、淋巴、脾、前肌、腎、輸卵管、小腸、子宮、背膘等組織，－80 ℃保存。子宮組織用于HoxA10基因cDNA序列擴增，所有組織用于基因表達規(guī)律分析。

1.2 豬HoxA10基因預測

將人HoxA10基因 cDNA序列（GeneBank NM_153715.3）與豬全基因組序列比對，定位豬HoxA10基因。根據(jù)人HoxA10基因信息及外顯子-內(nèi)含子交接的GT-AG規(guī)則，對豬HoxA10基因進行預測，并對外顯子進行拼接，最終獲得豬HoxA10基因的預測cDNA序列及可能的基因結(jié)構(gòu)。

1.3 引物設計

根據(jù)預測的豬HoxA10基因cDNA序列，共設計了3對引物（表1）。P1用于豬HoxA10基因cDNA序列擴增；qs-hoxa用于該基因各組織表達分析，qs-actin為內(nèi)參基因β-actin引物。所有引物均使用Genetool軟件設計，送由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 各引物基本信息Table 1 Descriptions of the 3 primers used in this study

1.4 HoxA10基因 cDNA序列擴增

用常規(guī)Trizol方法，抽提豬各組織中總RNA，用 TOYOBO公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將各組織的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并以看家基因（β-actin）引物擴增，驗證反轉(zhuǎn)錄是否成功，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｒ宰訉mcDNA為模板，RT-PCR 擴增HoxA10基因cDNA序列，10 μL反應體系中包括：0.4 μL cDNA、0.25UTaqDNA polymerase （東盛生物）、12.5 pmol P1或P2、5 μL 2×PCR Reaction Mix，其余用ddH2O補齊。PCR反應條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，32個循環(huán)，最后72℃延伸5 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并切膠純化后連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞，進行克隆測序。

1.5 豬HoxA10基因序列分析與功能預測

1.5.1 物種間HoxA10基因CDS的同源性分析

登錄NCBI的BLAST程序[10]，在GenBank數(shù)據(jù)庫選擇“Nucleotide blast”，將所得到的豬HoxA10基因CDS序列輸入NCBI/Blast軟件的序列輸入框內(nèi)，選擇程序“Megablast”進行同源性檢索；采用DNAstar軟件中的MegAlign對豬HoxA10基因CDS序列與 BLAST得到的其他物種的HoxA10基因CDS序列（圖2）進行同源性比對。

1.5.2 蛋白質(zhì)功能預測

采用 ExPASY的 ComputepI/MW 程序和SAPS（statistical analysis of protein sequences），對HoxA10基因蛋白序列的相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點進行分析。

采用網(wǎng)上的motif數(shù)據(jù)庫進行motif、結(jié)構(gòu)位點、機構(gòu)功能域功能預測。

1.5.3 9個物種HoxA10基因的系統(tǒng)進化分析

利用MEGA3.1程序，對不同動物HoxA10或pHoxA10基因的核苷酸序列進行BLAST分析，再計算物種間的同源距離，并通過鄰近歸并法構(gòu)建物種間系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.6 熒光定量PCR

選用SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO，Japan）試劑盒，用 ABI PRISM?7500 Sequence Detection System（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA）分析儀對各組織HoxA10基因mRNA豐度進行定量檢測。不同組織的HoxA10基因mRNA拷貝數(shù)使用β-actin作為內(nèi)參進行校正。目的基因熒光定量PCR引物為qs-hoxa，內(nèi)參基因的引物為qsactin。采用20 μL反應體系，其中包括5 μL cDNA模板，10 μL 2 × Q-PCR SYBR Green Mix，0.5 μL的上下游引物，其余用蒸餾水補齊。每個樣本設3個重復，分別使用引物qs-hoxa和qs-actin進行擴增。PCR按 ABI公司提供的程序和優(yōu)化后的退火溫度進行。PCR產(chǎn)物特異性使用溶解曲線判定。每個組織HoxA10基因 mRNA的相對表達量用 2-ΔΔCt表示，其中，ΔCt=目的基因Ct- 內(nèi)參Ct；ΔΔCt=待測樣品中目的基因ΔCt- 參照樣品中目的基因ΔCt（若無參照樣品則選擇ΔCt最大的樣品為參照進行計算，本試驗中以脾臟中目的基因ΔCt為參照） 。

2 結(jié) 果

2.1 豬HoxA10 cDNA克隆

對豬HoxA10基因預測的結(jié)果顯示，HoxA10基因位于豬18號染色體正鏈44195018—44204802，由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，cDNA序列長2 247 bp，預計編碼合成94個氨基酸殘基。RT-PCR結(jié)果顯示，從豬子宮組織中克隆獲得HoxA10基因cDNA長538 bp，包括1個285 bp的開放閱讀框，共編碼合成94個氨基酸殘基（圖1），與預測相同。

圖1 豬HoxA10基因cDNA序列Fig. 1 cDNA sequence of pig HoxA10 gene

2.2 豬HoxA10基因序列分析與功能預測

2.2.1 物種間HoxA10基因CDS的同源性分析

從NCBI網(wǎng)站收集了9個物種HoxA10基因的CDS及氨基酸序列（表 2）。用 DNAstar軟件中的MegAlign對各序列間的同源性進行分析（表3），發(fā)現(xiàn)豬的CDS與牛的同源性最高，達到94.7%；豬的CDS與人和小鼠的同源性分別為90.9%和90.5%；氨基酸同源性比對顯示，豬與人、牛的氨基酸同源性達到了98.9%，與小鼠的同源性為97.9%。

表2 9個物種HoxA10的蛋白質(zhì)和cDNA序列Table 2 Protein and cDNA sequences of HoxA10 among 9 species

表3 不同物種HoxA10基因CDS序列及氨基酸序列的同源性比較Table 3 Homology of HoxA10 CDS and its amino acid sequences among different species

2.2.2 蛋白質(zhì)功能預測

豬HoxA10蛋白序列的相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點的分析結(jié)果顯示，HoxA10蛋白相對分子質(zhì)量為1.15×104，在94個氨基酸殘基中共包含22個強正極性氨基酸（如K、R），9個強負極性氨基酸（如D、E），等電點為10.60，推測為一個堿性氨基酸。

2.3 9個物種HoxA10或pHoxA10基因的系統(tǒng)進化分析

聚類分析顯示，9個物種被劃分為界線清晰的4個類群，狨猴、狒狒、人等靈長類聚為一類，狗和小鼠聚為一類，雞和斑馬魚各自成一類（圖2）。

圖2 9個動物種的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree among 9 animal species

2.4 豬HoxA10基因組織表達

豬HoxA10基因在很多組織都有表達，其中，前肌的表達量最高，腹脂、后肌、腎、大腸、輸卵管、子宮也有較高的表達，脾、淋巴、肝、小腸的表達較低。另外，垂體、大腦、小腦、丘腦、卵巢、肺、胃、小腸、背肌、背膘等10種組織中，HoxA10的表達很低或無表達。

3 討論與結(jié)論

本試驗中從豬的子宮組織中克隆了HoxA10基因的cDNA，其序列長538 bp，包括一個285 bp的ORF（開放閱讀框），編碼94個氨基酸殘基；144 bp的5'UTR和109 bp的3'UTR；該基因在豬各組織中均有表達，以前肌的表達量最高；其次為腎、子宮、后肌、輸卵管等組織；脾、淋巴、肝、小腸的表達較低；在垂體、大腦、小腦、丘腦、卵巢、肺、胃、小腸、背肌、背膘等組織中基本無表達。HoxA10基因在生殖系統(tǒng)的發(fā)育以及胚胎著床等生殖過程中有重要作用。HoxA10基因敲除的雌性小鼠會出現(xiàn)胚胎著床障礙，雄性小鼠會出現(xiàn)雙側(cè)隱睪和副性器官以及精子發(fā)育障礙等；因此，推測HoxA10基因在胚胎形成過程中參與調(diào)節(jié)泌尿生殖管的發(fā)育，也是維持個體生殖力的重要因素[11]。通過對本試驗獲得的HoxA10序列進行分析，結(jié)果顯示，該基因的 CDS與牛的同源性最高，達到94.7%；與人和小鼠的同源性分別為90.9%、90.5%。聚類分析也顯示，豬與牛的親緣關系最近，與斑馬魚親緣關系較遠。9個物種的HoxA10氨基酸序列系統(tǒng)進化樹也與幾類動物（靈長類、低等哺乳動物、禽類、魚類）的分類學及人類對于動物進化的認識一致；因此，所獲序列為豬HoxA10基因序列，與預測的結(jié)果相同。據(jù)報道，在人和小鼠中，HoxA10基因均有2個轉(zhuǎn)錄本，本試驗中只利用人的其中一種轉(zhuǎn)錄本為參照進行豬HoxA10基因的序列預測。同樣，根據(jù)人HoxA10基因的另一種轉(zhuǎn)錄本進行預測，豬HoxA10基因也與人和小鼠一樣存在另一種轉(zhuǎn)錄本，本課題組擬對此預測結(jié)果進行驗證。

從基因的表達規(guī)律看，HoxA10基因在豬的各組織中分布不是很廣泛，以前肌的表達量最高，腎、子宮、后肌、輸卵管等組織也有較高的表達。Blitek等[12]用促性腺激素誘導豬動情，檢測豬早期妊娠在第10、11、12、15 d中HoxA10基因在子宮內(nèi)膜和孕體中的表達，發(fā)現(xiàn)HoxA10的表達在第12天和第15天均明顯上調(diào)，表明HoxA10基因在成年豬的子宮內(nèi)膜是有表達的。Taylor等[7]也發(fā)現(xiàn)，在小鼠胚胎發(fā)育過程中，HoxA10基因在苗勒管和成熟子宮內(nèi)膜中均有表達。本研究結(jié)果也顯示，豬HoxA10基因在子宮和輸卵管中也有較高的表達，與人和小鼠等類似。豬HoxA10基因在腎中表達較高，預示該基因參與調(diào)節(jié)泌尿生殖管的發(fā)育。豬HoxA10基因在子宮和輸卵管的較高表達，表明該基因與豬的繁殖性狀有顯著的相關性，可能是影響豬生殖調(diào)控以及與繁殖性狀相關的重要的候選基因。

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英文編輯：羅文翠