張素輝，曹國(guó)文，陳春林，邱進(jìn)杰

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

為了觀察項(xiàng)目組研制的三個(gè)中藥組方對(duì)預(yù)防和治療雞傳染性支氣管炎的安全性和有效性，本試驗(yàn)采用IBV-M41標(biāo)準(zhǔn)株感染雞胚，觀察其作用效果，為臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 中藥提取液 依據(jù)麻杏石甘散進(jìn)行組方加減，

得到三個(gè)中藥組方。采用蒸餾法和水提醇沉法提取，并經(jīng)10000r/min高速離心取上清液制得。

1.1.2 種毒 雞傳染性支氣管炎病毒（IBV-M41株），購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)雞胚 9日齡SPF雞胚，購(gòu)自山東濟(jì)南某家禽科技有限公司。

1.1.4 試劑及儀器 試劑包括生理鹽水、10 000IU/mL雙抗等。儀器包括孵化箱、高壓滅菌鍋、離心機(jī)、無(wú)菌操作臺(tái)、水浴鍋。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病毒復(fù)壯 IBV-M41株使用前用雞胚復(fù)壯，種毒按1∶1000稀釋，經(jīng)尿囊腔接種于9日齡SPF雞胚，每胚0.1mL。37℃培養(yǎng)72h，收集雞胚尿囊液，加入10%10000IU/mL雙抗混勻，以2000r/min離心15min，取上清作為病毒感染液備用。

1.2.2 IBV-M41毒株雞胚半數(shù)感染量（EID50）的測(cè)定 將IBV-M41毒株用生理鹽水按10倍系列連續(xù)稀釋成8個(gè)稀釋度，取105至108稀釋梯度的稀釋液接種于9日齡雞胚尿囊腔，每個(gè)稀釋度接種5枚雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，另設(shè)4枚雞胚為空白對(duì)照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，每間隔10h照蛋，記錄死胚數(shù)和有典型病變的雞胚數(shù)，7d內(nèi)死亡的隨時(shí)取出放于4℃冰箱中保存，24h內(nèi)死亡的胚不計(jì)。按Reed-Muench方法計(jì)算EID50。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組 將140枚9日齡SPF雞胚統(tǒng)一在孵化箱中孵化，分別按以下方法分組并處理：

中藥提取液安全性測(cè)定組：將三個(gè)組方的中藥提取液用生理鹽水分別作100倍稀釋后再作連續(xù)2倍比稀釋，取連續(xù)5個(gè)稀釋度的稀釋液接種9日齡雞胚，每個(gè)稀釋度接種3枚雞胚，每枚雞胚接種0.1mL，另設(shè)2枚雞胚為空白對(duì)照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經(jīng)10 h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察3 d，每天觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚情況。最后根據(jù)存活雞胚數(shù)判定中藥對(duì)雞胚的毒性，找到無(wú)毒性最大濃度，該濃度即為對(duì)雞胚的最大安全濃度。

中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力阻斷作用的測(cè)定組：將最大安全濃度的中藥提取液0.1mL接種于9日齡雞胚，將雞胚置于37.5℃孵化箱中作用，分別于2、4、8、16、24h后取出，再將含有200×EID50的病毒液按0.1mL/枚接種于雞胚。每種方法接種3枚雞胚，另設(shè)3枚雞胚作空白對(duì)照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經(jīng)10h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察7d，每天觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚情況。

中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力抑制作用的測(cè)定組：將含有200×EID50的病毒液0.1 mL接種于9日齡雞胚，將雞胚置于37.5℃孵化箱中保溫，2、4、8、16、24 h后取出，再將最大安全濃度的中藥液按0.1 mL/枚接種于雞胚。每種方法接種3枚雞胚，另設(shè)3枚雞胚作空白對(duì)照。將雞胚置于37.5℃孵化箱中孵化，經(jīng)10h間隔照蛋，棄去死亡雞胚。連續(xù)觀察7d，每天觀察雞胚發(fā)育情況，記錄死胚情況。

2 試驗(yàn)結(jié)果

從病毒復(fù)壯試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雞胚接種病毒后36 h，雞胚發(fā)育開(kāi)始減緩，第3 d出現(xiàn)雞胚死亡，死亡高峰出現(xiàn)在第5、6 d，7 d后雞胚死亡率達(dá)70%。雞胚主要表現(xiàn)發(fā)育遲滯，胚體矮小，羊膜增厚，卵黃囊縮小，尿囊液增多。

2.1 IBV-M41毒株EID50的測(cè)定結(jié)果 IBV-M41毒株EID50為0.2mL 10-6.58倍稀釋的病毒液，雞胚整體發(fā)育不良，胚體小，畸形。空白對(duì)照組全部存活。

2.2 中藥提取液安全性測(cè)定結(jié)果 由表1可知，在同一個(gè)稀釋梯度：組方1與組方2、組方3相比，其安全性較好，在100×20倍稀釋度時(shí)對(duì)雞胚發(fā)育影響不明顯，毒性不大；組方2在100×23倍稀釋度時(shí)對(duì)雞胚發(fā)育無(wú)影響，100×20至100×22倍稀釋度時(shí)對(duì)雞胚發(fā)育有致畸作用；組方3在100×20倍稀釋度時(shí)對(duì)雞胚發(fā)育有影響，與對(duì)照胚比較，胚體萎縮，個(gè)別頭部有出血，胚體發(fā)育小。

表1 中藥提取液安全性測(cè)定結(jié)果

2.3 中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力阻斷作用的測(cè)定結(jié)果 由表2可知，組方1對(duì)IBV-M41株的阻斷效果較好，其最佳作用時(shí)間為4～16h階段。

表2 中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力的阻斷作用

2.4 中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力抑制作用的測(cè)定結(jié)果 由表3可知，組方1對(duì)IBV-M41株的抑制作用較好，其最佳作用時(shí)間為2～8h階段。

表3 中藥提取液在雞胚水平上對(duì)病毒毒力的抑制作用

3 討論

3.1 用IBV-M41感染SPF雞胚，7 d致死率達(dá)70%，其病變和致死率與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致，表明人工感染造模成功。

3.2 從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，組方1提取液能顯著阻斷和抑制IBV-M41對(duì)SPF雞胚的毒害作用，從而有效地保護(hù)雞胚免受侵害。在對(duì)病毒毒力阻斷作用進(jìn)行測(cè)定的試驗(yàn)中，先注入中藥提取液再在不同時(shí)段接種IBV-M41，三個(gè)組方中，均為16 h和24 h階段的死亡率較高，說(shuō)明該組方在37.5℃的雞胚中藥效代謝較快，在經(jīng)過(guò)16 h后，對(duì)IBV-M41株作用減弱；在2、4 h和8 h試驗(yàn)階段，只有組方1沒(méi)有死亡雞胚出現(xiàn)，其他均有不同程度的死亡和弱胚，說(shuō)明組方1對(duì)IBV的阻斷效果較好。在對(duì)病毒毒力抑制作用進(jìn)行測(cè)定的試驗(yàn)中，先接種IBV再在不同時(shí)段注入中藥提取液時(shí)，三個(gè)組方中，均為16 h和24 h階段的死亡率較高，說(shuō)明病毒在37.5℃的雞胚中經(jīng)過(guò)16～24 h孵化后，病毒量達(dá)到較高滴度致雞胚死亡；在2、4 h和8 h試驗(yàn)階段，只有組方1沒(méi)有死亡雞胚出現(xiàn)，其他均有不同程度的死亡和弱胚，說(shuō)明組方1對(duì)IBV的抑制效果較好。

3.3 由試驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的三個(gè)中藥組方提取液在雞胚中對(duì)IBV的阻斷和抑制試驗(yàn)取得了較滿意的結(jié)果，以組方1效果最為明顯，其中尤以對(duì)病毒的阻斷作用極佳。其作用機(jī)理可能為：中藥與雞胚作用后，中藥提取液提高了雞胚的免疫力，有效阻止了病毒的吸附和侵入。而中藥組方對(duì)病毒的抑制作用試驗(yàn)中，病毒侵染雞胚后再添加中藥，中藥樣品對(duì)雞胚內(nèi)的病毒起一定的抑制作用，抑制了病毒的生物合成及成熟釋放。其具體作用機(jī)理有待于進(jìn)一步探明。

3.4 麻杏石甘散中，麻黃具有宣通肺氣以平喘，杏仁降氣化痰以平喘止咳，二藥相合增強(qiáng)了清肺化痰、止咳平喘的作用。石膏清泄肺熱，甘草有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、調(diào)和諸藥等功能。麻杏石甘湯方劑對(duì)目前生產(chǎn)中常發(fā)的呼吸道疾病有明顯的治療作用，也有抗病毒和抑菌作用。陳玥等研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘提取物對(duì)哮喘大鼠有抑制體重減輕，延長(zhǎng)引喘潛伏期，恢復(fù)機(jī)體的白細(xì)胞數(shù)目及正常分布，降低血及肺組織中ET-1含量，改善肺部支氣管組織病理形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)等作用。本試驗(yàn)對(duì)配方進(jìn)行加減，并對(duì)其提取液的功效加以比較，為雞傳染性支氣管炎等病毒性疾病的治療和預(yù)防提供了基礎(chǔ)資料。

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