祁昱 白麗民 馬佳 潘岳 劉兵 賈莉

摘要：目的：觀察雞胚營養(yǎng)組合物對衰老大鼠基因損傷修復(fù)的影響，探討其延緩衰老的可能機制。方法：采用D半乳糖建立衰老SD大鼠動物模型，每日1次頸背部皮下注射 D半乳糖500mg/（kg·d），連續(xù)造模90天，對照組頸背部皮下注射等劑量的生理鹽水注射液。從第1天起，雞胚營養(yǎng)組合物組、雞胚組、營養(yǎng)組合物組、蛋清組，分別以相應(yīng)劑量對大鼠進行灌胃，每天1次，直至第90天，拉頸處死大鼠。取各組大鼠肝臟、骨髓和腦組織，采用RTPCR法檢測各組織修復(fù)基因的表達情況。結(jié)果：與衰老模型組相比，雞胚營養(yǎng)組合物組衰老大鼠肝臟和骨髓組織中錯配修復(fù)基因MSH2表達量升高（P<005）;雞胚營養(yǎng)組合物組衰老大鼠肝臟組織中同源重組修復(fù)基因Xrcc1、Xrcc2、骨髓中同源重組修復(fù)基因Rad51以及腦組織中同源重組修復(fù)基因Rad51、Xrcc1表達量升高（P<005）。結(jié)論：雞胚營養(yǎng)組合物能夠修復(fù)衰老大鼠肝臟、骨髓和腦組織基因的損傷，此可能為其延緩衰老的作用機制之一。

關(guān)鍵詞：衰老;雞胚;營養(yǎng)組合物;修復(fù)基因

研究表明，氨基酸、核苷酸、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)有助于基因的復(fù)制以及損傷基因的自主修復(fù)[12]。雞胚蛋含有大量生物活性物質(zhì)[3]。因此，本研究采用D半乳糖建立衰老動物模型，探討雞胚營養(yǎng)組合物對衰老大鼠基因損傷修復(fù)系統(tǒng)的影響，為雞胚營養(yǎng)組合物對延緩衰老的臨床治療提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11材料

實驗動物：SD大鼠60只，由大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（SYXK 20130006）。營養(yǎng)組合物：由大連金斧公司提供，由賴氨酸、色氨酸、精氨酸、甘氨酸、?；撬?、核苷酸、維生素C、維生素D、維生素B12、葉酸、鈣、鐵、鋅、硒等52種物質(zhì)組成，按原方比率配方，經(jīng)水煎、超聲、濃縮，配制成口服液，分裝備用。

主要試劑及儀器：D半乳糖（美國Sigma公司）、PCR儀（BIORAD）、凝膠成像分析儀（美國UVP公司AUTO MULTICHEMI）。

12大鼠衰老模型的建立

50只SD大鼠每日頸背部皮下注射D半乳糖500mg/kg，連續(xù)注射90天。正常對照組10只SD大鼠每日頸背部皮下注射等劑量的生理鹽水。每日稱重，并調(diào)整造模用藥的劑量。

13實驗分組及流程

60只SD大鼠隨機分為6個組：①正常對照組，10只大鼠，每日1次頸背部皮下注射500mg/（kg·d）的生理鹽水，②衰老模型組，10只大鼠，每日1次注射D半乳糖500mg/（kg·d），連續(xù)造模90d;③雞胚營養(yǎng)組合物組，10只大鼠，建模的同時以雞胚（用量同雞胚組）和營養(yǎng)組合物混合物進行灌胃;④雞胚組，10只大鼠，建模的同時選取第3天胚齡的雞蛋，每個雞蛋取3mL雞胚液，以1mL雞胚液對大鼠進行灌胃;⑤營養(yǎng)組合物組，10只大鼠，建模的同時，1～15天以0381 6g/d 對大鼠進行灌胃，16～30天以0763 2g/d 對大鼠進行灌胃，30～90天以1144 8g/d對大鼠進行灌胃;⑥蛋清組，10只大鼠，建模的同時選取未受精的雞蛋，每個雞蛋取3mL蛋清，以1mL蛋清液對大鼠進行灌胃（由于雞胚組、營養(yǎng)組合物組皆含有氨基酸類，因此特設(shè)蛋清組）。直至第90天，頸椎脫臼處死大鼠，每組留取大鼠肝臟組織，骨髓以及腦組織進行RTPCR檢測。

14RTPCR

141Trizol法提取總RNA取大鼠肝臟、骨髓和腦組織各100mg，加入1mL Trizol，室溫靜置5min;加入02mL氯仿，4℃，12 000g離心15min;加入等體積異丙醇，混勻，;棄上清，加入1mL預(yù)冷的75%乙醇， 充分洗滌沉淀， 4℃，7 500g離心5min;加入10μL DEPC水;紫外分光光度計測定A260和A280，以檢測RNA含量和純度。

142RTPCR分析反轉(zhuǎn)錄體系20μL，包含樣品RNA 1μL，按照TaKaRa的反轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的說明書進行操作。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：65℃ 1min，30℃ 5min，65℃ 15min，98℃ 5min，5℃ 5min。PCR反應(yīng)體系50μL，包含反轉(zhuǎn)錄液10μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性1min;97℃變性20s，64℃退火20s， 72℃ 20s延伸，循環(huán)30次;72℃延伸5min，4℃恒定。取5μL PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下凝膠成像。引物見附表。

15統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 170統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，P<005為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果與分析

21雞胚營養(yǎng)組合物對衰老大鼠錯配修復(fù)基因的影響

圖1A顯示，在肝臟組織中，與正常對照組大鼠錯配修復(fù)基因MSH2（075±008）相比，衰老模型組MSH2表達量（036±002）下降（P<005）;與衰老模型組相比，雞胚組和營養(yǎng)組合物組MSH2表達量均升高 （P<005），但其表達量均低于雞胚營養(yǎng)組合物組（057±005），蛋清組大鼠MSH2表達量無明顯變化（P>005）;而錯配修復(fù)基因PMS2、MLH1、MSH3在肝臟組織中無明顯變化（P>005）。圖1B顯示，在骨髓組織中，與正常對照組大鼠MSH2（046±007）相比，衰老模型組MSH2表達量（020±004）下降（P<005）;與衰老模型組相比，雞胚組和營養(yǎng)組合物組大鼠MSH2表達量升高（P<005），但其表達量仍低于雞胚營養(yǎng)組合物組（043±006），蛋清組大鼠MSH2表達量無明顯變化（P>005）;而錯配修復(fù)基因PMS2、MLH1、MSH3在骨髓組織中無明顯變化（P>005）。圖1C顯示，在腦組織中，各組錯配修復(fù)基因無明顯變化（P>005）。

22雞胚營養(yǎng)組合物對衰老大鼠同源重組修復(fù)基因的影響

圖2A顯示，在肝臟組織中，與正常對照組中大鼠同源重組修復(fù)基因Xrcc1（082±006）和Xrcc2（038±003）相比，衰老模型組中Xrcc1（017±004）、Xrcc2（015±002）表達量均降低（P<005）;與衰老模型組相比，雞胚和營養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，Xrcc1、Xrcc2表達量均升高（P<005），但雞胚營養(yǎng)組合物組中Xrcc1（077±007）、Xrcc2（036±002）表達量最高，而蛋清組大鼠Xrcc1、Xrcc2表達量無明顯變化（P>005）;而重組修復(fù)基因Rad51、Rad52在肝臟組織中無明顯變化（P>005）。

圖2B顯示，在骨髓中，與正常對照組中大鼠同源重組修復(fù)基因Rad51（035±003）相比，衰老模型組Rad51（014±002）表達量下調(diào)（P<005）;與衰老模型組相比，蛋清組Rad51表達量無明顯變化（P>005），雞胚營養(yǎng)組合物組、雞胚組、營養(yǎng)組合物組中大鼠Rad51表達量均上調(diào)（P<005），但雞胚營養(yǎng)組合物組大鼠Rad51（031±007）表達量最高;而重組修復(fù)基因Rad52、Xrcc1、Xrcc2在骨髓中均無明顯變化（P>005）。

圖2C顯示，在腦組織中，與正常對照組中大鼠同源重組修復(fù)基因Rad51（040±007）和Xrcc1（056±006）的相比，衰老模型組Rad51（015±002）、Xrcc1（015±005）表達量均降低（P<005）;雞胚和營養(yǎng)組合物處理衰老大鼠后，Rad51、Xrcc1表達量均增高（P<005），但雞胚營養(yǎng)組合物組中Rad51（036±007）、Xrcc1（047±007）表達量最高;與衰老模型組相比，蛋清組大鼠Rad51、Xrcc1表達量均無明顯變化（P>005）;而重組修復(fù)基因Rad52、Xrcc2在腦組織中無明顯變化（P>005）。

3討論

探討雞胚營養(yǎng)組合物調(diào)節(jié)修復(fù)損傷DNA的能力對于延緩衰老，預(yù)防老年性疾病方面具有重要的臨床應(yīng)用[45]。

有文獻證實，錯配修復(fù)基因MSH2缺失會造成微衛(wèi)星不穩(wěn)定，從而加速衰老[67]。本研究顯示，雞胚營養(yǎng)組合物可以有效恢復(fù)衰老大鼠肝臟和骨髓組織中MSH2的表達量，這表明雞胚營養(yǎng)組合物能夠修復(fù)機體因衰老造成的錯配修復(fù)基因缺失。本研究顯示，雞胚營養(yǎng)組合物可以有效恢復(fù)衰老大鼠肝臟、骨髓和腦組織中Rad51的表達水平，表明雞胚營養(yǎng)組合物可以在一定程度上延緩細(xì)胞衰老。進一步研究顯示，同源重組修復(fù)基因Xrcc1的部分丟失會導(dǎo)致小鼠腦損傷增加，小鼠缺血性中風(fēng)恢復(fù)能力降低[8]。我們的研究結(jié)果同樣證實了雞胚營養(yǎng)組合物促進衰老大鼠肝臟及腦中Xrcc1的表達，進而對衰老大鼠同源重組修復(fù)基因的損傷具有恢復(fù)作用。

綜上所述，雞胚營養(yǎng)組合物可以有效提高衰老大鼠DNA損傷修復(fù)能力，為其應(yīng)用于臨床延緩衰老的治療提供了科學(xué)依據(jù)?！?/p>

參考文獻

[1]Ou HL， Schumacher B DNA damage responses and p53 in the aging process [J] Blood，2018，131（5）： 488495

[2]苗小艷，賈莉，楊佩滿營養(yǎng)組合物對再生障礙性貧血小鼠肝干細(xì)胞的影響[J]中國老年學(xué)雜志，2015，35（13）：35363538

[3]李曦 雞胚蛋對免疫力低下小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能研究[D]江南大學(xué)，2012

[4]Bonnet A E， Marchalant Y Potential Therapeutical Contributions of the Endocannabinoid System towards Aging and Alzheimers Disease [J] Aging and Disease，2015， 6（5）： 400405

[5]Chatterjee N，Walker GC Mechanisms of DNA damage， repair， and mutagenesis[J] Environ Mol Mutagen，2017，58（5）： 235263

[6]Li Z，et al DNA mismatch repair and the DNA damage response[J] DNA Repair （Amst），2016（38）：94101

[7]李勇，金梅花，全吉淑，等錯配修復(fù)蛋白MSH2和MSH6在衰老SD大鼠組織中的表達及其意義[J]延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)學(xué)報，2010，33（4）：249250

[8]Ghosh S， Canugovi C， Yoon JS， ，et al Partial loss of the DNA repair scaffolding protein， Xrcc1， results in increased brain damage and reduced recovery from ischemic stroke in mice[J] Neurobiol Aging，2015， 36（7）： 23192330