王宜艷,孫虎山,周彥菊,閆冬春,王 磊

(魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山東 煙臺(tái) 264025)

谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶(Glutathione S-transferases,GST,EC2.5.1.18),也稱為不含硒谷胱甘肽過氧化物酶(nonSeGPx),是一組多功能同功酶,其主要功能是催化谷胱甘肽(GSH)與各種內(nèi)源性和外源性有害的親電子化合物反應(yīng),生成無(wú)毒性或毒性小的GSH硫結(jié)合物; 同時(shí)能催化有機(jī)過氧化物還原成相應(yīng)的醇,與硒谷胱甘肽過氧化物酶(SeGPx)協(xié)同作用起抗氧化作用[1]。軟體動(dòng)物的雙殼類、腹足類和頭足類的鰓、足、外套膜和消化腺等組織中都廣泛存在著 GSH及其相關(guān)酶(SeGPx、GST和谷胱甘肽還原酶等),并在其抗氧化和解毒中起重要作用[2-5]。近10年來(lái),國(guó)外有關(guān)貝類體內(nèi) GST的研究報(bào)道較多,多集中在重金屬、殺蟲劑和石油污染物等對(duì)GST等抗氧化因子和生物異源物質(zhì)代謝系統(tǒng)的影響[2,6-13],對(duì) GST等抗氧化因子的季節(jié)變化也有研究報(bào)道[14-16],研究的主要熱點(diǎn)是探討 GST等抗氧化因子在應(yīng)激狀態(tài)下的作用及作為環(huán)境污染的生物標(biāo)志物的可行性; 國(guó)內(nèi)有關(guān)貝類 GSH及其相關(guān)酶的研究報(bào)道極少[17-18]。對(duì)貝類體內(nèi)GST性質(zhì)的研究國(guó)內(nèi)外均未見研究報(bào)道。作者以人工養(yǎng)殖的櫛孔扇貝(C.farreri)為材料,采用生化測(cè)定的方法對(duì)其血淋巴中GST活性及部分性質(zhì)進(jìn)行了初步研究,以期為貝類防御機(jī)理的研究積累資料,也為貝類體內(nèi)GST的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

櫛孔扇貝購(gòu)自煙臺(tái)水產(chǎn)市場(chǎng),殼長(zhǎng) 40～50 mm,暫養(yǎng)于室內(nèi)充氣的砂濾海水水族箱內(nèi)。還原型谷肽胱甘肽、1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 血清和血細(xì)胞的制備

用5mL注射器和5號(hào)針頭從櫛孔扇貝閉殼肌血竇中抽取血淋巴,每次實(shí)驗(yàn)取 5只扇貝的血淋巴混合作為樣品,4℃、3500 r/min離心10 min,取上清即血清用于血清中GST活力的測(cè)定。下層沉淀即血細(xì)胞中加入與血清等量的雙蒸水低滲溶血后,4℃、6000 r/min離心10 min,取上清液即血細(xì)胞裂解液用于血細(xì)胞中GST活力的測(cè)定。樣品制備后立即用于酶活測(cè)定,未用完的血樣品置于4℃冰箱中保存不超過 12 h。

1.3 GST活性力測(cè)定

GST活力測(cè)定采用CDNB比色法[8],略有改進(jìn)。對(duì)照管中依次加入0.1 mol/L、pH 6.5的磷酸緩沖液(PBS)0.1 mL、10 mmol/L的 GSH 0.1 mL及 1.25 mmol/L的CDNB 0.8 mL,測(cè)定管中以等量血樣品取代PBS,25℃恒溫下準(zhǔn)確反應(yīng)5 min; 然后在對(duì)照管中依次加入10%的鹽酸0.1 mL、血樣品0.1 mL、蒸餾水1.8 mL,測(cè)定管中用等量PBS取代血樣品; 1 cm石英比色皿、340 nm下以對(duì)照管作空白,讀取測(cè)定管的吸光度。測(cè)定管設(shè)5個(gè)平行組。采用Lowry等[10]的福林-酚試劑法測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量。酶活力單位的定義：每毫克蛋白每分鐘催化生成1 μmol產(chǎn)物所需要的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。數(shù)據(jù)處理采用T檢驗(yàn)。

1.4 GST性質(zhì)的研究

1.4.1 溫度及pH對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響

以0.1 mol/L、pH 6.5的PSB為緩沖液,分別在5、10、15、20、25、30、35、40、60℃的反應(yīng)條件下測(cè)定酶活力,以測(cè)定溫度對(duì)血細(xì)胞中 GST活力的影響。

以25℃為測(cè)定溫度,分別以pH 5、5.5、6、7、7.5和8的0.1 mol/L的PBS為緩沖液,測(cè)定pH對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響。

1.4.2 血細(xì)胞中GST的熱穩(wěn)定性

將血細(xì)胞裂解液分別在 20、25、30、35℃恒溫中放置30 min后; 在4℃中分別保存12、24 h后,以0.1 mol/L、pH 6.5的PBS為緩沖液,25℃測(cè)該酶的反應(yīng)速率,以測(cè)定該酶的熱穩(wěn)定性。

1.4.3 金屬離子銅、鉛對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響

分別以硫酸銅和硝酸鉛為抑制劑,以0.1 mol/L、pH 6.5的檸檬酸-檸檬酸鈉為緩沖液,分別配制銅、鉛離子終質(zhì)量濃度為：0、0.05、0.25、0.5、2.5、5 mg/L的反應(yīng)液,在25℃測(cè)得該酶的反應(yīng)速率。

2 結(jié)果

2.1 血清和血細(xì)胞中GST活力

櫛孔扇血清和血細(xì)胞中GST活力的測(cè)定結(jié)果見表1。由表1可見,櫛孔扇貝血清和血細(xì)胞中均存在GST,血細(xì)胞中 GST活力遠(yuǎn)高于血清中的,是血清中的12倍。

表1 櫛孔扇貝血清和血細(xì)胞中GST活力Tab 1 Activity of Glutathione S-transferases in the haemolymph of C.farreri

2.2 溫度對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響

溫度對(duì)血細(xì)胞中GST活力影響的測(cè)定結(jié)果見圖1。結(jié)果表明：隨溫度的升高酶活力出現(xiàn)先升后降的趨勢(shì),該酶的最適溫度范圍為20～35℃。GST在5℃的低溫下活力很低,僅為 48.14 U,10℃時(shí)活力有所升高,15℃時(shí)活力快速升高,為5℃時(shí)的3倍多; 30℃時(shí)酶活力達(dá)最高值,后隨溫度的繼續(xù)升高而下降,35℃時(shí)活力較 30℃下降了 20%,40℃時(shí)其活力只有30℃時(shí)的23%,60℃時(shí)該酶已完全喪失活力。

圖1 溫度對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞中GST活力的影響Fig.1 Effects of temperature on GST activity in haemocytes of C.farreri

2.3 pH對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響

pH對(duì)血細(xì)胞中 GST活力影響的測(cè)定結(jié)果見圖2。結(jié)果表明：pH為5時(shí)GST活力較低僅為62.31 U,pH為5.5和6時(shí),酶活力有所升高,但變化不明顯;pH為7.5時(shí)酶活力達(dá)最高值,為240.06 U。pH為7和8時(shí)酶活力分別達(dá)到最高值的61%和76%。該酶的適宜pH為7～8,最適pH為7.5。

圖2 pH對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞中GST活力的影響Fig.2 Effects of pH on GST activity in haemocytes of C.farreri

2.4 血細(xì)胞中GST的熱穩(wěn)定性

4℃時(shí)血細(xì)胞中GST穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果見圖3。結(jié)果表明：4℃時(shí) GST活力隨保存時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。4℃保存12 h后GST活力已下降了51%,4℃保存24 h后酶活力僅有原活力的32%。說明此酶在低溫中保存也易失活,低溫保存時(shí)間最好不要超過 12 h。

血細(xì)胞中GST熱穩(wěn)定性的測(cè)定結(jié)果見圖 4。結(jié)果表明：血細(xì)胞裂解液在不同溫度下保溫30 min后,該酶隨溫度的升高活力逐漸降低,35℃時(shí)酶的活力顯著降低,為20℃時(shí)的22%,為30℃的29%。因此,該酶熱穩(wěn)定性較差。

圖4 櫛孔扇貝血細(xì)胞中GST的熱穩(wěn)定性Fig.4 Heat stabilities of GST in haemocytes of C.farreri

2.5 銅和鉛離子對(duì)血細(xì)胞中GST活力的影響

Cu2+對(duì)血細(xì)胞GST活力影響的測(cè)定結(jié)果見圖5。結(jié)果表明：Cu2+對(duì)該酶活力有明顯抑制作用,隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。Cu2+質(zhì)量濃度為0.25 mg/L該酶活力較對(duì)照組已下降了近 40%; 當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度升高到0.5 mg/L時(shí)其活力較對(duì)照組下降了78%; 當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度升高到2.5 mg/L時(shí)酶活力已接近0。

圖5 Cu2+對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞中GST活力的影響Fig.5 Effects of Cu2+ on GST activity in haemocytes of C.farreri

Pb離子對(duì)血細(xì)胞GST活力影響的測(cè)定結(jié)果見圖6。結(jié)果表明：Pb2+對(duì)GST活力也有明顯抑制作用,隨著 Pb2+質(zhì)量濃度的升高抑制作用增強(qiáng)。Pb2+為0.05mg/L時(shí)酶活力較對(duì)照組已下降了51%; Pb2+質(zhì)量濃度升高到5mg/L時(shí)該酶失活。

圖6 Pb2+對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞中GST活力的影響Fig.6 Effects of Pb2+ on GST activity in haemocytes of C.farreri

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,櫛孔扇貝血細(xì)胞 GST的最適溫度為 30℃,較馬素永等[19]CDNB法測(cè)得玉米螟(Ostrinia furnacalis)GST的最適溫度41℃為低; 尹登科等[20]利用大腸桿菌表達(dá)日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)GST后,CDNB法測(cè)得其最適作用溫度為37℃,也高于本實(shí)驗(yàn)結(jié)果; 日本血吸蟲 GST對(duì)溫度的穩(wěn)定性也高于櫛孔扇貝。玉米螟GST最適pH為6.3～6.9,日本血吸蟲GST最適pH為7.0,均稍低于櫛孔扇貝。GST是一組多功能同功酶,為由多種不同亞基構(gòu)成的二聚體,不同物種不同組織中可有不同種類的GST[21],因此,在不同物種間可存在GST理化性質(zhì)的差異。櫛孔扇貝血細(xì)胞GST對(duì)溫度的穩(wěn)定性較差,室溫下對(duì)該酶操作易失活,用于實(shí)驗(yàn)的樣品在4℃保存時(shí)間最好不要超過12 h。櫛孔扇貝不同組織中GST同功酶的分型、分布等有待于進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)顯示,應(yīng)用CDNB法測(cè)定GST活力時(shí),緩沖液種類有影響作用,同為pH6.5的緩沖液,25℃為測(cè)定溫度的條件下,用PBS緩沖液較檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液酶活力要高出近 8倍,其原因有待進(jìn)一步研究。

貝類血細(xì)胞殺死被吞噬的病原菌等異物的主要機(jī)制之一是伴隨吞噬引起的呼吸突發(fā)產(chǎn)生的具殺菌作用的超氧陰離子和 H2O2等活性氧,活性氧對(duì)貝類機(jī)體也有毒害作用,須及時(shí)清除。GSH可通過巰基與體內(nèi)自由基結(jié)合轉(zhuǎn)化成容易代謝的酸性物質(zhì),從而加速超氧陰離子、H2O2和脂質(zhì)過氧自由基等自由基的排泄,同時(shí)GSH又可通過GST發(fā)揮作用,抑制脂質(zhì)過氧化,保護(hù)細(xì)胞膜恢復(fù)細(xì)胞功能,并可保護(hù)細(xì)胞內(nèi)含巰基的酶的活性,防止因巰基氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性,減少自由基對(duì) DNA的攻擊,從而減少DNA損傷和突變[3]。本文結(jié)果表明扇貝的血淋巴中含有GST,說明扇貝體內(nèi)也存在GST和GSH清除自由基的免疫防御機(jī)制。

貽貝(Mytella guyanensis)等濾食性雙殼貝類組織中的 GSH、GST、SeGPx等對(duì)水中重金屬離子等污染物比較敏感,污染物含量高的組織中 GST等的活力也較高[11,13],因此,某些貝類體內(nèi)的 GST等可作為污染的生物標(biāo)志物。但不同污染物對(duì)貝組織中GST活力的影響不同[6],已有報(bào)道顯示不同質(zhì)量濃度金屬離子暴露實(shí)驗(yàn)對(duì)貝類GST活性影響無(wú)一致的規(guī)律,有的顯示GST活性無(wú)改變[12],有的顯示GST活性降低[10]。Hunaitia等[22]用不同質(zhì)量濃度的氯化鉛體外(37℃)孵育人全血24 h后,血液中GST活性隨 Pb+質(zhì)量濃度升高而下降,說明鉛對(duì) GST活力抑制作用的存在。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,金屬離子銅和鉛對(duì)櫛孔扇貝血細(xì)胞GST活性有顯著直接抑制作用。對(duì)貝類組織中GST性質(zhì)尤其是抑制劑、激活劑的研究對(duì)GST作為污染的生物標(biāo)志物的應(yīng)用有一定的參考價(jià)值。

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