楊鵬等

摘 要 以巴西橡膠樹無性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的未開割樹為材料，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析乳管細(xì)胞中HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5個(gè)橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因的晝夜表達(dá)模式。結(jié)果表明：5個(gè)基因的表達(dá)均具有節(jié)律性，而且不同基因在同一無性系中以及同一基因在不同無性系間的節(jié)律性表達(dá)模式都有一定程度的差異。結(jié)果為分析不同環(huán)境因素對(duì)橡膠生物合成相關(guān)酶基因節(jié)律性表達(dá)的影響具有一定參考價(jià)值。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；膠乳；橡膠生物合成相關(guān)酶；節(jié)律性表達(dá)

中圖分類號(hào) S794.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Rhythmic Expression of Genes Encoding Enzymes for

Rubber Biosynthesis in Rubber Trees

YANG Peng1，2， ZHANG Shixin2， CHEN Huiping1， TIAN Weimin1，2 *

1 College of Horticulture and Landscape Architecture， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Rubber Research Institute， CATAS/Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture/State Key Laboratory Incubation Base for Cultivation and Physiology of Tropical Crops， Danzhou， Hainan 571737， China

Abstract The day and night expression pattern of FDPS， SRPP， HMGR1， REF and HRT2 encoding the enzymes for rubber biosynthesis in rubber tree clones（PR107， RRIM600， CATAS7-33-97and CATAS8-79）were analyzed by quantitative PCR technique. The expression of all the five genes appeared to be day and night rhythm. The rhythmic expression pattern was different to some extent either among different genes in the same clone or among different clones for the same gene. This is valuable for investigating the effects of environmental factors on the rhythmic expression of genes encoding the key enzymes for rubber biosynthesis in rubber tree.

Key words Hevea brasiliensis Muell. Arg.； Latex； Key enzymes for rubber biosynthesis； Rhythmic expression

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.09.007

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis Müll. Arg.）是天然橡膠的主要來源，而天然橡膠生物合成是典型的植物類異戊二烯代謝途徑，有多種酶類參與，如HMG-CoA還原酶1（3-Hydroxy-3-Methylglutaryl Coenzyme A Reductase 1， HMGR1）、法尼基焦磷酸合成酶（Farnesyl Diphosphate Synthase， FDPS）、小橡膠粒子蛋白（Small Rubber Particle Protein， SRPP）、橡膠延伸因子（Rubber Elongation Factor， REF）和橡膠轉(zhuǎn)移酶（Rubber Transferase， HRT）等。目前對(duì)這些酶的研究較多：HMGR催化由HMG-CoA形成甲羥戊酸（Mavalonic acid， MVA），繼而合成異戊烯焦磷酸（IPP）[1]，在煙草中表達(dá)HMGR1、HMGR2基因，導(dǎo)致甾醇的含量增加[2-3]，在小粒種咖啡（Coffea arabica）中，HMGR1表達(dá)存在時(shí)間差異性[4]；FDPS催化一分子二甲基丙烯焦磷酸和兩分子異戊烯基焦磷酸以1、4頭尾連續(xù)縮合反應(yīng)，而形成法尼基焦磷酸（FPP）[5]，橡膠生物合成的效率與細(xì)胞內(nèi)的FPP濃度呈正相關(guān)[6]；FDPS在植物中起到甾醇合成和三萜類生物合成的調(diào)節(jié)作用[7]；SRPP和REF是橡膠粒子膜蛋白，兩者與脂質(zhì)膜的結(jié)合方式不同，REF嵌入到半個(gè)單位膜中，SRPP僅結(jié)合在膜的表面[8-9]，REF的表達(dá)與橡膠合成量成正相關(guān)[10]，在蒲公英中，SRPP對(duì)橡膠合成效率和橡膠合成穩(wěn)定性具有非常關(guān)鍵的作用[11-12]；HRT1和HRT2在橡膠樹的膠乳中特異表達(dá)[13]，在俄羅斯蒲公英中，HRT參與橡膠合成[14]。

生物節(jié)律在植物生命過程中扮演著重要的角色，是植物對(duì)環(huán)境的一種適應(yīng)性機(jī)制[15-16]，這種生物節(jié)律在分子水平上表現(xiàn)為基因的節(jié)律性表達(dá)[17]。模式植物擬蘭芥大約有1/3基因?qū)儆跁r(shí)鐘調(diào)節(jié)基因[18]。由于橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因不是典型的時(shí)鐘基因，所以幾乎所有關(guān)于環(huán)境因素對(duì)橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)的研究都沒有考慮基因的節(jié)律性表達(dá)。因此，本文以橡膠樹無性系品系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的4 a未開割樹為材料，采用熒光定量PCR技術(shù)，分析5個(gè)橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因的晝夜表達(dá)模式，以期為基因表達(dá)分析研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

巴西橡膠樹無性系PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79的4 a未開割樹，種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所試驗(yàn)基地。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 選取大小和長勢一致的3株P(guān)R107植株，采用針刺法從主干不同部位收集膠乳。第一個(gè)部位距芽接樁30 cm，從該部位往上，以正面-背面交錯(cuò)方式再選取8個(gè)部位，相鄰位置間相隔15 cm，同時(shí)在9個(gè)位置用針刺法采集膠乳樣品。每株樹每個(gè)部位的膠乳分別提取總RNA，通過熒光定量PCR分析基因在樹干不同部位的表達(dá)。

選取6株大小和長勢較一致的PR107植株，其中，3株作針刺處理，3株為對(duì)照。針刺處理的部位距離芽接樁30 cm。針刺處理4 h 后，在處理位置上方15 cm處的樹干背面采集膠乳。對(duì)照組在對(duì)應(yīng)高度采集膠乳。每株樹的膠乳分別提取總RNA，通過熒光定量PCR分析針刺處理對(duì)臨近部位基因表達(dá)的影響。

分別從4個(gè)無性系中選取3株大小和長勢一致的植株，分別在6 ： 00、10 ： 00、14 ： 00、18 ： 00、22 ： 00、次日2 ： 00、次日4 ： 00、次日6 ： 00、次日10 ： 00等9個(gè)時(shí)間點(diǎn)，用針刺法由下往上從樹干的9個(gè)部位采集膠乳。每株樹的每個(gè)部位的膠乳分別提取總RNA，通過熒光定量PCR分析基因的晝夜表達(dá)模式。

1.2.2 膠乳中總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 使用天根生化科技（北京）有限公司多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DP441）提取膠乳總RNA，方法參照試劑盒說明書。提取的膠乳總RNA通過瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性并使用美國Thermo Electron Corporation的微量紫外分光光度計(jì)（Gene company Limited NO2000）測定濃度，各取800 ng RNA進(jìn)行等量反轉(zhuǎn)錄，方法參照試劑盒（#K1621）說明書。

1.2.3 熒光定量PCR 將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為模版，使用美國Bio-Rad Laboratories， Inc.的CFX96/384 Touch Real-Time PCR Detection System進(jìn)行熒光定量PCR分析。使用寶生物工程（大連）有限公司的SYBRR Premix Ex TaqTM II（RR820A）配制反應(yīng)體系，以HbACTIN為內(nèi)參基因。熒光定量PCR反應(yīng)體系見表1。引物序列及擴(kuò)增效率見表2。

熒光定量PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃/63.3 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s；60～95 ℃做熔解曲線分析，每個(gè)溫度以每步0.2 ℃上升，每個(gè)溫度停留5 s。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 使用SAS8.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。采用One-way ANOVA 中的Duncan多重對(duì)比分析不同數(shù)據(jù)組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹樹干不同高度的膠乳中基因表達(dá)分析

熒光定量PCR分析結(jié)果表明，HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5個(gè)基因在樹干不同部位的表達(dá)存在一定程度的差異（圖1），這可能與砧木的不同導(dǎo)致株間差異有關(guān)。但通過SAS軟件進(jìn)行單樣本T檢測，這些差異并未達(dá)到顯著水平。

2.2 針刺處理對(duì)鄰近部位橡膠合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

離芽接樁30 cm處的樹干部位作針刺處理，4 h后在距離處理位置15 cm處的樹干背面采集膠乳。對(duì)照不作任何處理，在相應(yīng)高度處采集膠乳。結(jié)果表明，HMGR1、FDPS、SRPP、REF和HRT2等5個(gè)基因表達(dá)量在處理和對(duì)照間存在一定程度的差異，但差異不顯著（p>0.05）（圖2）。

2.3 不同基因在同一無性系中的表達(dá)分析

在無性系PR107中，膠乳中的5個(gè)基因在白天的表達(dá)呈上升趨勢，到18 ： 00達(dá)到最高峰，隨后在22 ： 00開始下調(diào)。但是表達(dá)量處于低谷的時(shí)間點(diǎn)存在一定差異，其中，HMGR1和FDPS的低谷出現(xiàn)在第2天10 ： 00，而SRPP、REF和HRT2的表達(dá)最低點(diǎn)在第2天06 ： 00。在RRIM600中，5個(gè)基因在白天都持續(xù)上調(diào)表達(dá)，但是，表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)存在差異。HMGR1和FDPS的表達(dá)高峰出現(xiàn)在22 ： 00，而SRPP、REF和HRT2的表達(dá)高峰在第2天02 ： 00。在CATAS7-33-97中，5個(gè)基因在白天持續(xù)上調(diào)表達(dá)，最高峰出現(xiàn)在18 ： 00到22 ： 00之間，但表達(dá)低谷都在06 ： 00。在CATAS8-79中，5個(gè)基因表達(dá)在白天（06 ： 00至14 ： 00）都呈下調(diào)表達(dá)，但是表達(dá)低谷出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)存在差異，其中HMGR1的表達(dá)低谷出現(xiàn)在22 ： 00，F(xiàn)DPS、SRPP和REF的表達(dá)低谷出現(xiàn)在10 ： 00，HRT2的表達(dá)低谷出現(xiàn)在14 ： 00（圖3）。

2.4 同一基因在不同無性系間的表達(dá)分析

HMGR1在PR107、RRIM600、CATAS7-33-97和CATAS8-79中的表達(dá)高峰分別出現(xiàn)在14 ： 00、18 ： 00、14 ： 00和06 ： 00，其表達(dá)低谷分別出現(xiàn)在10 ： 00、10 ： 00、6 ： 00和22 ： 00。在CATAS8-79中，該基因在白天的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，而在其他3個(gè)無性系中，該基因在白天的表達(dá)呈上調(diào)趨勢。FDPS表達(dá)的上下調(diào)趨勢在PR107和CATAS8-79中相似，但是表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)不同。在PR107中，表達(dá)高峰出現(xiàn)在14 ： 00，而在CATAS8-79中，表達(dá)高峰出現(xiàn)在02 ： 00。FDPS在RRIM600和CATAS7-33-97中都是白天緩慢上調(diào)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在22 ： 00。SRPP、REF和HRT2基因在PR107和CATAS7-33-97中的表達(dá)高峰出現(xiàn)在18 ： 00，而在RRIM600和CATAS8-79中的表達(dá)高峰出現(xiàn)在02 ： 00（圖3）。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，相同基因在樹干不同部位的表達(dá)量沒有顯著性差異，局部針刺對(duì)鄰近部位的基因表達(dá)也沒有明顯影響，因此，不同時(shí)間點(diǎn)的膠乳樣品可以采自同一植株樹干的不同部位，可避免株間差異的干擾。

本文所選的5個(gè)橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性表達(dá)，但是橡膠樹無性系PR107和RRIM600之間的基因表達(dá)模式存在較大差異，每個(gè)基因表達(dá)高峰出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)在這2個(gè)品系間都不相同。SRPP、REF和HRT2基因在無性系CATAS7-33-97中的表達(dá)模式與PR107相似，而REF、HRT2和SPRR基因在CATAS8-79中的表達(dá)模式相對(duì)傾向于RRIM600。由于這些材料都種植在同一環(huán)境中，所以基因表達(dá)的差異性和相似性主要取決于遺傳因素。根據(jù)4個(gè)品系的遺傳圖譜（圖4），無性系CATAS7-33-97的親本是RRIM600和PR107[19]，而CATAS8-79分別與RRIM600和PR107有1/4的血緣[20]。

有研究結(jié)果表明 ：在擬蘭芥中時(shí)間調(diào)控的核心時(shí)鐘基因受到EARLY FLOWERING 3（AtELF3）的調(diào)控[21]；在一些組織中有數(shù)千個(gè)基因在時(shí)鐘基因的調(diào)控下做規(guī)律性震蕩[22]。因此，時(shí)鐘基因的應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)分為三個(gè)層次：核心時(shí)鐘基因、上游生物鐘調(diào)節(jié)器和下游時(shí)鐘應(yīng)答基因[23-24]。通過下游節(jié)律性表達(dá)基因找到上游核心時(shí)鐘調(diào)控基因，繼而發(fā)現(xiàn)時(shí)鐘調(diào)節(jié)器，有助于研究生物的生理表現(xiàn)，改良生物的適應(yīng)能力等[25]。雖然本研究所選擇的橡膠生物合成關(guān)鍵酶基因不屬于核心時(shí)鐘基因，但是這些基因表達(dá)具有明顯的節(jié)律性，而且這種節(jié)律性表達(dá)在不同無性系中都存在，表明其具有一定的代表性。從研究結(jié)果可推測這些基因可能處于鐘基因應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)的下游，而對(duì)于環(huán)境因素對(duì)基因表達(dá)的影響還有待進(jìn)一步研究。

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