周一兵,陳雪,楊大佐,萬良,王斌,王麗麗,孫靜波

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023;2.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心,遼寧大連116023;3.寶生物工程(大連)有限公司,遼寧大連116600)

雙齒圍沙蠶CYP4基因的克隆及序列分析

周一兵1,陳雪1,楊大佐1,萬良1,王斌1,王麗麗2,孫靜波3

(1.大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室,遼寧大連116023;2.國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心,遼寧大連116023;3.寶生物工程(大連)有限公司,遼寧大連116600)

根據(jù)已知的綠沙蠶Nereis virens細胞色素氧化酶CYP342A1保守區(qū)設(shè)計引物,采用RACE技術(shù)首次從雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis體壁肌肉中克隆出細胞色素氧化酶CYP4基因全長序列。分析結(jié)果表明,該序列全長為1 857 bp,5′端非翻譯區(qū)為186 bp,3′端非翻譯區(qū)為225 bp,閱讀框為1 446 bp,編碼為481個氨基酸。第422～431氨基酸序列符合P450所具有的結(jié)構(gòu)保守共有序列FxxGxxxCxG,第319～322氨基酸序列為K螺旋特征基序ExxR區(qū),第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTT。經(jīng)Blast與GenBank中已知物種的氨基酸序列進行同源性比對,CYP4與多毛類綠沙蠶Nereis virens CYP4BB1、CYP342A1(AY453408)氨基酸同源性為73%、36%,與多毛類小頭蟲Capitella capitata CYP4AT1 (AY574044)同源性為39%。據(jù)此推斷,雙齒圍沙蠶CYP4基因?qū)儆贑YP4B亞家族。

雙齒圍沙蠶;CYP4;RACE;生物信息學(xué)分析

細胞色素P450酶系(CYP酶)是存在于所有生物體中的超基因家族,其中CYP4是細胞色素P450酶系中的一個重要家族。研究表明,CYP4與多種生物代謝、解毒和抗藥性機制相關(guān)[1-4]。細胞色素氧化酶P450家族是多毛類體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化的第一階段代謝酶,在外源性化合物代謝中起著極其重要的作用,這與脊椎動物體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化相似[5]。有報道指出,無脊椎動物亦具有AhR的同構(gòu)物,并具有前者的典型特征,但其對芳香族化合物尚缺乏高特異性的結(jié)合能力,這與脊椎動物明顯不同[4]。關(guān)于細胞色素P450基因特性的研究,無論是對其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控還是對其特定的生化活性在海洋無脊椎動物尤其是多毛類沙蠶的報道都是十分有限的。因此,應(yīng)用分子生物學(xué)方法確定和研究海洋無脊椎動物CYP酶系組成的多樣性及其功能特征,既能克服方法學(xué)上存在的問題,又可有效地揭示海洋無脊椎動物CYP酶系不同家族之間結(jié)構(gòu)多樣性的特征。迄今為止,在多毛類中已克隆出4種P450基因,包括2004年克隆出綠沙蠶Nereis virens CYP4家族(CYP342A1)及其亞家族成員(CYP4BB1)[4],還有2005年公布的小頭蟲Capitella capitate CYP4AT1和CYP331[6]。

雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis廣泛分布于沿海潮間帶及河口灘地,既是重要的經(jīng)濟多毛類動物,又是外源性化學(xué)物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化機制中重要的決定性物種。因此,克隆沙蠶CYP4基因,研究其表達與調(diào)控規(guī)律,既有助于揭示沙蠶對芳香族化合物的代謝特征和解毒機制,也可為建立以沙蠶健康評價為基礎(chǔ)的海洋沉積環(huán)境早期污染生態(tài)風險評價的基因診斷方法提供依據(jù)。本研究中,作者采用RTPCR和RACE法,首次獲得完整的雙齒圍沙蠶CYP4基因序列,以期為今后進一步研究該基因在受到有機污染物脅迫下的表達規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

研究用雙齒圍沙蠶采自遼寧省盤錦雙臺子河口,挑選3尾體質(zhì)量為1.5～2.0 g的個體,將其放置在加冰的泡沫保溫箱內(nèi)運送到大連海洋大學(xué)遼寧省海洋生物資源恢復(fù)與生境修復(fù)重點實驗室暫養(yǎng),每天更換一次海水。試驗所用海水取自大連市

黑石礁海區(qū),經(jīng)沉淀、砂濾后貯存?zhèn)溆?。試驗海水中Cu(Ⅱ)、Hg(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Pb(Ⅱ)和Cd(Ⅱ)的背景濃度分別為0.38、0.01、75、0.27、0.06 μg/L,鹽度為31～32,pH為8.25± 0.10,水溫為(18±0.5)℃。

1.2 方法

1.2.1 總RNA的提取 研缽使用液氮預(yù)冷,取0.1 g雙齒圍沙蠶體壁肌肉,迅速投入預(yù)冷研缽中,加入適量液氮并研磨成粉末狀,再按照RNAiso Pius(購自TAKARA公司)說明書提取總RNA,最終溶于DEPC處理水中。經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗總RNA的完整性,使用紫外分光光度計測定其濃度。于-80℃下保存,備用。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)近源物種Nereis virens細胞色素氧化酶CYP342A1 CDs(登錄號AY453408)找到保守區(qū)域設(shè)計一對簡并引物,以雙齒圍沙蠶的總RNA為模板,反轉(zhuǎn)錄擴增出特異性片斷,并對其進行序列測定和比對。根據(jù)得到的CYP4基因片段設(shè)計3′RACE和5′RACE引物。

1.2.3 cDNA第一鏈合成及特異性片段擴增 用已提取的雙齒圍沙蠶總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,按照Takara RNA PCR Kit(AMV)Ver.3.0試劑盒(購自TAKARA公司)說明合成cDNA第一鏈及PCR反應(yīng)。cDNA第一鏈合成反應(yīng)條件:30℃下反應(yīng)10 min,42℃下反應(yīng)30 min,99℃下反應(yīng)5 min,5℃下反應(yīng)5 min。特異性片段PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性2 min;94℃下變性30 s,47℃下退火30 s,72℃下延伸30 s,共進行32個循環(huán);72℃下再延伸10 min。

取5 μL PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢驗PCR擴增效果后,再用EZ Spin Column DNA Gel Extraction Kit切膠回收試劑盒(購自上海生工有限公司)切膠回收。回收后的產(chǎn)物與TaKaRa pMDTM19-T Vector載體連接進行TA克隆,熱轉(zhuǎn)化至E.coli Competent Cells JM109中,涂布于Amp/X-gal/IPTG/LB平板,37℃下過夜培養(yǎng)。挑選獨立5株陽性菌斑加入至LB液體培養(yǎng)基(含Amp)中培養(yǎng)16 h,送由上海生工有限公司測序。

1.2.4 RACE擴增 使用Clontech SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(購自Clontech公司)試劑盒,按照其說明書進行3′RACE擴增。3′RACE PCR反應(yīng)條件:94℃下變性30 s,72℃下延伸3 min,共進行5個循環(huán);94℃下變性30 s,70℃下退火30 s,72℃下延伸3 min,共進行5個循環(huán); 94℃下變性30 s,68℃下退火30 s,72℃下延伸3 min,共進行25個循環(huán)。

使用TaKaRa LA Taq?with GC Buffer、TaKaRa 5′-Full RACE Kit(購自TAKARA公司)試劑盒,按照其說明書對總RNA進行去磷酸化處理、“去帽子”反應(yīng),并與5′RACE Adaptor連接后,反轉(zhuǎn)錄合成5′RACE的cDNA,再進行PCR擴增。5′RACE PCR反應(yīng)條件:94℃下預(yù)變性3 min;94℃下變性30 s,53℃下退火30 s,72℃下延伸1 min,共進行35個循環(huán);72℃下再延伸10 min。

序列測定由TAKARA公司完成,應(yīng)用DNA Star軟件將得到的序列拼接成完整的cDNA序列。

1.2.5 序列分析 將推導(dǎo)的氨基酸序列使用Blast進行同源性比對,用DNA Star預(yù)測等電點、相對分子質(zhì)量,進行TMHMM跨膜區(qū)分析、Motif Scan氨基酸MOTIF分析、PSORT功能位點分析,用SignalP預(yù)測信號肽,再進行ExPASy-ProtScale疏水性分析、SOMPA蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測、Clustal W氨基酸序列多重比對,并使用Mega 4.0軟件構(gòu)建同源關(guān)系進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性片段擴增及RACE擴增

提取的總RNA經(jīng)15 g/L瓊脂糖電泳檢查,可清晰地看到5S、18S和28S核糖體RNA條帶(圖1 -a)。結(jié)果顯示,OD260nm/OD280nm值為1.86～1.88,RNA完整性和均一性好,無降解現(xiàn)象。

根據(jù)近源物種Nereis virens CDs找保守區(qū)域設(shè)計引物,經(jīng)PCR產(chǎn)物割膠后克隆測序得到442 bp的特異性片段條帶(圖1-b)。通過優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,用3′RACE PCR擴增得到371 bp核苷酸序列(圖1-c),用5′RACE PCR擴增獲得一段1 044 bp核苷酸序列(圖1-d)。經(jīng)DNA Star序列拼接,得到1 857 bp完整的雙齒圍沙蠶CYP4 cDNA全序列,并提交GenBank,登錄號為HM126463。

圖1 雙齒圍沙蠶RNA提取結(jié)果及CYP4 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The total RNA and PCR amplified product of CYP4 from P.aibuhitensis

2.2 序列分析

序列分析結(jié)果顯示,雙齒圍沙蠶CYP4基因為P450家族的新成員,其cDNA包括5′非翻譯區(qū)186 bp,3′非翻譯區(qū)225 bp,開放閱讀框為1 446 bp,編碼為481個氨基酸(圖2)。CYP4基因的理論等電點為7.25,相對分子質(zhì)量為55 726.61。對SignalP信號肽和信號肽位點的分析結(jié)果顯示,雙齒圍沙蠶CYP4蛋白沒有明顯的信號肽位點,可能為非分泌蛋白。采用TMHMM對CYP4氨基酸序列的跨膜區(qū)進行分析,CYP4蛋白無明顯的跨膜區(qū),推測其可能是可溶性蛋白。根據(jù)ProtScale預(yù)測結(jié)果,CYP4基因編碼的氨基酸序列疏水性最大為2.70,最小值為-3.40,均值為-0.86。整個多肽鏈中大多數(shù)氨基酸的分值較低,親水性氨基酸多于疏水性氨基酸,據(jù)此推斷該蛋白為親水性的。用SOMPA預(yù)測雙齒圍沙蠶CYP4基因編碼的蛋白二級結(jié)構(gòu)中含α-螺旋為43.66%,β轉(zhuǎn)角為5.82%,延伸鏈為13.10%,無規(guī)則卷曲為37.42%。由CYP4 cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列中,第282～294氨基酸序列含有CYP4家族特征序列EVDTFMFEGHDTT,其中M由L代替,而谷氨酸殘基(E)只存在于CYP4家族中;第319～322氨基酸序列為K螺旋特征基序ExxR區(qū);血紅素結(jié)合區(qū)保守序列為FxxGxxxCxG,第422～431氨基酸序列符合P450所具有結(jié)構(gòu)保守的血紅素結(jié)合區(qū)共有序列。

將雙齒圍沙蠶CYP4序列提交到NCBI,使用在線Blast進行同源性比較。結(jié)果表明,CYP4基因氨基酸序列與多毛類綠沙蠶Nereis virens CYP4BB1、CYP342A1的同源性分別為73%、36%,與多毛類小頭蟲Capitella capitata CYP4AT1的同源性為39%。與軟體動物袖扣海兔螺Cyphoma gibbosum CYP4BK1、菲律賓蛤仔Venerupisphilippinarum CYP4、櫛孔扇貝Chlamys farreri CYP4,環(huán)節(jié)動物囊舌蟲Saccoglossus kowalevskii CYP4-like,兩棲動物非洲爪蟾Xenopus(Silurana)tropicalis CYP4B1-like以及哺乳動物人Homo sapiens CYP4F、蘇門達臘猩猩Pongo abelii CYP4F12、褐家鼠Rattus norvegicus CYP4F1等推導(dǎo)的氨基酸序列同源性為42%～51%。將雙齒圍沙蠶CYP4氨基酸序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫進行比較,經(jīng)Clustal W進行同源性比對分析,結(jié)果見圖3。應(yīng)用NJ法構(gòu)建的同源關(guān)系樹,結(jié)果見圖4,其中Bootstraping值為1000。綜上所述,推斷雙齒圍沙蠶CYP4基因為CYP4B亞家族新成員。

3 討論

本試驗中采用RACE擴增方法得到多毛類雙齒圍沙蠶CYP4cDNA全長序列。該序列全長為1 857 bp,開放閱讀框為1 446 bp,編碼為481個氨基酸。以往的研究表明,疏水螺旋I區(qū)(EVDTFMFEGHDTT)、K螺旋區(qū)(ExxR)和血紅素結(jié)合區(qū)(FxxGxxxCxG)普遍存在于P450家族中,這些被認為是鑒定P450家族的特征序列[7-9]。本試驗中由所獲得的CYP4 cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)第282～294氨基酸序列具有疏水螺旋I區(qū),其中M由L代替;第319～322氨基酸序列存在K螺旋特征基序ExxR區(qū);CYP4第422～431氨基酸序列符合P450所具有的結(jié)構(gòu)保守共有序列血紅素結(jié)合區(qū)。保守區(qū)非功能的個別氨基酸殘基變異屬于正常現(xiàn)象,并不影響該保守區(qū)域的鑒定。

圖2 雙齒圍沙蠶CYP4編碼基因全長cDNA及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequence of Perinereis aibuhitensis CYP4

圖3 雙齒圍沙蠶CYP4氨基酸序列與其它動物CYP4基因家族推導(dǎo)的氨基酸序列的比對分析(由Clustal W軟件分析獲得)Fig.3 The alignment of deduced protein sequence of CYP4 with seleceted amino acid sequences was performed using Clustal W

細胞色素P450是一個成員眾多的超基因家族,基于PCR的分子克隆技術(shù)可以有效地鑒定其家族基因組成的多樣性,近年來已確定了一系列CYP酶系的新基因。Rewitz等[4]最先從多毛類綠沙蠶中

鑒定出兩種具有一定分化的CYP cDNA序列。分析表明,它們均屬于CYP4家族,其最大的相似性表現(xiàn)為均具有谷氨酸殘基(E),被認為這是CYP4家族的典型特征。另外,根據(jù)國際細胞色素P450命名委員會命名規(guī)則,如果CYP氨基酸序列與CYP4酶系的同源性＞40%,視為CYP4同一家族;在此基礎(chǔ)上,相同氨基酸序列的同源性＞55%,便可認定其屬于CYP4家族中的亞家族成員[10]。迄今為止,在多毛類中已克隆出5種P450基因,如Rewitz等[4]從綠沙蠶腸道中分離出CYP4家族CYP342A1及其亞家族成員CYP4BB1,二者的氨基酸序列與哺乳動物CYP4F酶具有極高的同源性,分別達到61%和58%。環(huán)節(jié)動物的P450酶基因主要是從腸道微粒體中分離出來,而本試驗中首次從雙齒圍沙蠶體壁肌肉中獲得CYP4基因,說明該基因存在部位具有廣泛性。本試驗中得到的CYP4 cDNA序列全長編碼為481個氨基酸,根據(jù)同源關(guān)系分析,雙齒圍沙蠶CYP4與綠沙蠶Nereis virens CYP4BB1的同源性最高為73%;與軟體動物Cyphoma gibbosum CYP4BK1同源性為48%;與兩棲動物Xenopus(Silurana)tropicalis CYP4B1同源性為43%;與哺乳動物的CYP4F亞家族的同源性為42%～47%。據(jù)此可推斷,本試驗中由雙齒圍沙蠶所得到的CYP4基因?qū)儆贑YP4B亞家族成員,同時同源關(guān)系樹也表明多毛類CYP4家族更接近CYP4F亞家族,這與Rewitz等[4]得到的結(jié)論是一致的。

圖4 根據(jù)CYP4氨基酸序列構(gòu)建的同源關(guān)系樹Fig.4 Phylogenetic neighbour-joining tree of the 481 amino acid sequences of CYP4 with the corresponding regions of 11 representatives from other species

目前,關(guān)于脊椎動物中CYP酶對污染物代謝、去除作用的研究較為詳盡,但對無脊椎動物尤其對海洋無脊椎動物的了解還十分有限。有一種觀點認為,CYP酶系是海洋多毛類對多環(huán)芳烴(PAH)生物轉(zhuǎn)化代謝途徑中的重要酶類,與脊椎動物相似,PAH亦可能通過激活沙蠶體內(nèi)相關(guān)受體,進而誘導(dǎo)CYP基因表達[10]。海洋多毛類綠沙蠶及小頭蟲在受到持久性有機污染物多環(huán)芳烴等脅迫下,其P450基因表達量提高2～3倍[4,6]。關(guān)于其它海洋無脊椎動物細胞色素P450基因表達水平也有類似的報道[11-15]。這表明無脊椎動物的細胞色素P450基因轉(zhuǎn)錄水平稍高于脊椎動物,但是多環(huán)芳烴與芳香烴受體(AhR)相互作用導(dǎo)致CYP1A基因轉(zhuǎn)錄水平的上漲是原來的10～100倍[16]。無脊椎動物的細胞色素P450基因轉(zhuǎn)錄、翻譯的基本分子機制尚未闡明,但P450基因的表達調(diào)控有可能與脊椎動物類似,無脊椎動物也具有受體和相應(yīng)的表達調(diào)控原理,如金屬反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子(MTF1)[17]和維甲類X受體(RXR)[18]與脊椎動物類似。本研究中利用RT-PCR和RACE技術(shù)對雙齒圍沙蠶CYP4基因進行了克隆,獲得了1 857 bp的雙齒圍沙蠶CYP4 cDNA序列,既可揭示以沙蠶為代表的多毛類動物CYP4不同亞家族結(jié)構(gòu)的多樣性,又為進一步了解CYP4基因在沙蠶中的本底表達以及污染物暴露條件下的表達量變化奠定了基礎(chǔ)。

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Cloning and sequence analysis of cytochrome CYP4 family in polychaete Perinereis aibuhitensis

ZHOU Yi-bing1,CHEN Xue1,YANG Da-zuo1,WAN Liang1,WANG Bin1,WANG LI-li2,SUN Jing-bo3
(1.Key Laboratory of Marine Bio-resources Restoration and Habitat Reparation in Liaoning Province,Dalian Ocean University,Dalian 116023,China; 2.National Marine Environmental Monitoring Center,Dalian 116023,China,3.Takara Biotechnology(Dalian)Co,LTD,Dalian 116600,China)

In the present study,the partial cDNA of CYP4 was amplified from the total RNA of epidermis muscle of the polychaete,Perinereis aibuhitensis,by reverse transcription with the primers based upon the CYP342A1 from Nereis virens.Then other primers were designed according to the partial gene of Perinereis aibuhitensis CYP4,and two fragments about 371 bp and 1044 bp were obtained by using 3′RACE and 5′RACE.Sequence analysis revealed a 1857 bp cDNA containing the 186 bp 5′-untranslated region,225 bp 3′-untranslated regions and 1 446 bp open reading frame encoding 481 amino acid.The identity rate of deduced amino acid sequence of CYP4 was subjected to Blast searching in NCBI.The results showed that the CYP4 shared 73%identity with CYP4BB1,36%identity with CYP342A1 of Nereis virens and 39%identity with CYP4AT1 of Capitella capitate.The deduced amino acid sequence of CYP4 contained the conserved motifs of P450 family(FxxGxxxCxG)and had K-helix motifs of P450 family(ExxR).In addition,it has the characteristic sequences of CYP4 family(EVDTFMFEGHDTT).So it is inferred that the cDNA sequence might belong to the subfamily of CYP4B.

Perinereis aibuhitensis;CYP4;RACE;sequence analysis

Q78

A

2095-1388(2011)06-0507-07

2011-02-08

國家“863”計劃項目(2006AA10Z410);國家海洋公益性行業(yè)科研專項(200805069);國家自然科學(xué)基金資助項目(30901107,41106115)

周一兵(1957-),男,教授。E-mail:ybzhou@dlou.edu.cn