質(zhì)子劑量和DNA濃度對DNA損傷的影響

隋 麗 王 瀟 周平坤 倪嵋楠 孔福全楊 磊 劉建成 趙 葵

1 (中國原子能科學(xué)研究院 北京 102413)

2 (軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所 北京 100850)

空間環(huán)境的輻射源主要是銀河系宇宙射線和隨機發(fā)生的太陽粒子輻射(質(zhì)子事件)。其中，質(zhì)子含量最豐富，其次為α粒子和少量重離子[1]。模型計算表明[2?4]，飛往火星途中，每隔數(shù)天宇航員體內(nèi)的每個細(xì)胞就會被一個質(zhì)子擊中。因此，為合理估算空間輻射危害，質(zhì)子是需考慮的關(guān)鍵粒子之一。

質(zhì)子的電離本領(lǐng)和穿透能力強，徑跡結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穿過生物介質(zhì)時，可通過輻解水產(chǎn)生的自由基或直接電離分子的方式使DNA發(fā)生損傷。Hada等[5]用帶電離子束(p、Fe、C、Ti 和Si)照射線性T7 基因組DNA 水溶液，發(fā)現(xiàn) 1 GeV質(zhì)子照射產(chǎn)生的DNA損傷譜十分類似于高能鐵離子和其它重帶電粒子的DNA 損傷譜，與X 和γ射線相比，質(zhì)子能引起更多的誘發(fā)生物體潛在致死的DNA雙鏈斷裂。DNA具有傳遞遺傳信息、啟動細(xì)胞分裂及控制蛋白質(zhì)(包括酶)生物合成等生理功能[6]，是電離輻射引致細(xì)胞殺傷或轉(zhuǎn)化的主要靶分子。因此，測量DNA 損傷，評估質(zhì)子所致生物效應(yīng)，對于太空人員的健康危險性防護(hù)及放射治療腫瘤最優(yōu)化等具重要意義。

Leavitt等[7]用 32–2300 MeV 的質(zhì)子照射了2000只恒河猴和5000只小鼠，研究了不同能量質(zhì)子誘發(fā)的相對生物學(xué)效應(yīng)(RBE)。研究結(jié)果表明，較低能量質(zhì)子的穿透力有限，高劑量照射會引起嚴(yán)重的表面損傷；高能質(zhì)子(>38 MeV)的生物效應(yīng)與相同劑量的60Co γ射線相似，其RBE≈1。Clapp等[8]用 60 MeV質(zhì)子輻照小鼠，得質(zhì)子誘發(fā)腫瘤的RBE≤1。Burns等[9]用10 MeV質(zhì)子照射大鼠，則發(fā)現(xiàn)誘發(fā)皮膚腫瘤的RBE≈3。因此，評價質(zhì)子誘發(fā)的生物學(xué)效應(yīng)還需更多研究，以得到更多的實驗數(shù)據(jù)。

本文以超螺旋質(zhì)粒DNA為實驗對象，使用凝膠電泳技術(shù)，研究了劑量和DNA濃度對質(zhì)子誘發(fā)的DNA鏈斷裂產(chǎn)額的影響以及甘露醇的防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 DNA樣品

樣品pUC19質(zhì)粒DNA由寶生物工程(大連)有限公司制備，用CsCl-EtBr 密度梯度超離心法純化獲得，樣品溶于 10 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)和 1 mmol/L EDTA緩沖液中保存。樣品為含90%以上雙鏈共價閉環(huán)超螺旋形態(tài)，分子長度為2 686堿基對(bp)，原始濃度500 ng/μL。實驗中，DNA樣品分別處于未添加或添加600 mmol/L甘露醇的兩種溶液體系中。在DNA濃度響應(yīng)實驗中，DNA原始溶液用三重蒸餾水分別稀釋至 10、20、40、50、100 ng/μL的不同濃度，隨濃度增加，含水量依次減少。在劑量響應(yīng)實驗中，DNA溶液濃度均為20 ng/μL，每個樣品的含水量相同。

1.2 質(zhì)子輻照

輻照在中國原子能科學(xué)研究院 HI-13 串列加速器上進(jìn)行。質(zhì)子束經(jīng)金靶散射，再經(jīng) Q3D 磁譜儀偏轉(zhuǎn)和散焦，穿過50 μm 厚的Kapton 膜后，在大氣環(huán)境下對置于微量離心試管中體積為10 μL的不同DNA 樣品進(jìn)行均勻輻照。經(jīng)過膜和空氣層的能量損失，到達(dá)樣品表面時質(zhì)子能量～16 MeV，對應(yīng)的LET值(水中)～3.2 keV/μm，射程～2.79 mm。由于DNA樣品量較少，樣品高度對LET值的影響可忽略不計，加入甘露醇后對射程也無明顯影響。輻照劑量由位置靈敏探測器監(jiān)測，劑量點有10、20、30、40、50、100、200、300、650 Gy。每種樣品有兩個平行樣。輻照完成后，將對照(未輻照)和輻照DNA樣品存于–20oC冰箱內(nèi)備用。

1.3 凝膠電泳分析

將對照和輻照DNA樣品分別加入0.2倍體積6×載樣緩沖液，點入 1%瓊脂糖凝膠板，瓊脂糖凝膠中加入 0.5%的溴化乙錠(Ethidium Bromide，EtBr)，每孔加樣0.1 μg。用DYY-5型雙穩(wěn)定時電泳儀(北京六一儀器廠)，電壓4 V/cm，在0.5×TBE(44.5 mmol/L Tris, 44.5 mmol/L硼酸和1 mmol/L EDTA)緩沖液中電泳 90 min，用 AlphaEaseFC成像系統(tǒng)(Alpha Inotech公司，美國)獲取凝膠電泳圖像，并用配套離線軟件對電泳圖像中各區(qū)帶進(jìn)行定量分析。實驗誤差為兩組平行樣實驗的標(biāo)準(zhǔn)差。輻照樣品鏈斷裂產(chǎn)額與對照樣品相比，p<0.05。未加甘露醇樣品的鏈斷裂產(chǎn)額與加甘露醇樣品相比，p<0.01。

2 實驗結(jié)果和討論

2.1 DNA濃度對DNA損傷的影響

圖1中，泳道C為對照DNA樣品，泳道1–5為50 Gy質(zhì)子輻照DNA樣品，由左至右DNA濃度依次為100、50、40、20、10 ng/μL。由圖1(a)，隨著DNA濃度的降低，完整的超螺旋(Supercoiled, SC)形態(tài)的DNA逐漸減少，發(fā)生單鏈斷裂的開環(huán)(Open Circular, OC)形態(tài)的 DNA逐漸增加；在低于 20 ng/μL濃度的DNA樣品中還出現(xiàn)少量發(fā)生雙鏈斷裂的線性(Linear, L)形態(tài)的DNA分子。圖1(b)中的各樣品也表現(xiàn)出類似的DNA濃度響應(yīng)，DNA濃度越低，單鏈斷裂越明顯，但所占比例均低于未添加甘露醇的同濃度DNA樣品。

用AlphaEaseFC StandAlone分析軟件，對凝膠電泳實驗不同DNA樣品的電泳區(qū)帶進(jìn)行密度掃描和積分計算，得到不同濃度下，質(zhì)子輻照前后DNA樣品中三種分子形態(tài)(SC、OC、L)所占百分比，由式(1)、(2)計算 DNA鏈每質(zhì)粒分子單鏈斷裂(SSB)和雙鏈斷裂(DSB)數(shù)[10,11]：

式中，f (L)和f (SC)分別為線性和超螺旋DNA的份額。

圖1 16 MeV質(zhì)子輻照50 Gy的DNA的電泳圖譜，泳道1–5的DNA濃度分別為100, 50, 40, 20, 10 ng/μL (a)未添加甘露醇，(b)添加甘露醇Fig.1 Gel electrophoresis images of DNA solution of 100, 50, 40, 20 and 10 ng/μL (for Channel 1–5, respectively), without (a) or with (b) mannitol, irradiated to 50 Gy by 16 MeV proton beams. Channel C is the control.

由圖2，對未加入甘露醇的DNA溶液，DNA濃度由10 ng/μL增至100 ng/μL，每個質(zhì)粒的單鏈斷裂數(shù)由0.98迅速減至0.1左右，表現(xiàn)出較好的指數(shù)衰減規(guī)律。表明DNA濃度較低的溶液環(huán)境更利于質(zhì)子輻解自由基的擴(kuò)散，使一個DNA分子受到有效攻擊的自由基數(shù)更多，從而產(chǎn)生較嚴(yán)重的損傷。DNA濃度較高，則DNA分子間會有較多重疊，較致密地聚集在一起，使自由基只能攻擊外圍的DNA分子，阻止了自由基在溶液中的擴(kuò)散，降低了對DNA分子結(jié)構(gòu)的破壞作用。加有甘露醇的DNA樣品中出現(xiàn)的DNA濃度效應(yīng)，變化趨勢相對平緩，濃度由10 ng/μL增至100 ng/μL時，每質(zhì)粒SSB僅由0.29降至0.1。表明甘露醇具有清除自由基的能力，在DNA濃度低于20 ng/μL的溶液環(huán)境下尤為有效。當(dāng)DNA濃度>40 ng/μL時，兩種體系下SSB數(shù)目相差不多，特別是100 ng/μL時，SSB數(shù)目幾乎相當(dāng)(圖2)，這表明DNA濃度效應(yīng)可能主要源于DNA樣品的含水量。另一方面，這也反映了DNA濃度越高，在使DNA發(fā)生斷裂的反應(yīng)機制中，質(zhì)子直接作用于DNA分子所致斷裂比例可能會越多。

圖2 每質(zhì)粒DNA單鏈斷裂數(shù)目隨受照DNA溶液濃度的變化曲線Fig.2 Number of SSB per plasmid as a function of DNA concentration.

圖3表明，在不同DNA濃度溶液環(huán)境下，劑量對DNA損傷的影響符合靶學(xué)說關(guān)系[12]：

式中，D為輻照劑量，D37為SC%降至37%時的輻照劑量，N0為DNA的原始數(shù)，N為受劑量D后的未失活分子數(shù)。將各點數(shù)據(jù)用(3)式擬合后，得到10 ng/μL和100 ng/μL DNA樣品的D37分別為50 Gy和560 Gy，兩者相差十倍之多。表明在本實驗研究范圍，若想達(dá)到相同程度的DNA損傷，受照DNA溶液濃度越低所需輻照劑量越小。

圖3 質(zhì)子輻照前后殘余SC型DNA的劑量響應(yīng)曲線Fig.3 Dose response curves of fraction of residual SC-type DNA before and after protons irradiation.

2.2 劑量對DNA損傷的影響

圖4(a)為三種形態(tài)的DNA分子隨劑量的變化情況，可以看出，隨著輻照劑量的增加，DNA分子形態(tài)由完整的SC逐漸向OC和L型轉(zhuǎn)變。50 Gy時，OC形態(tài)成為主要成分，且出現(xiàn)少量的線性，即發(fā)生雙鏈斷裂的DNA分子。200 Gy時，SC型DNA分子完全消失，主要為OC和L型。電泳圖譜顯示此時L型DNA分子還出現(xiàn)拖帶現(xiàn)象，并逐漸變成無明顯帶型的DNA“Smear”，這是由于照射造成不同大小DNA片段的產(chǎn)生，此現(xiàn)象越明顯，說明DNA損傷越嚴(yán)重。劑量達(dá)650 Gy，就不再存在SC型和OC型的DNA分子，均表現(xiàn)為長短不同的L形態(tài)，即均已發(fā)生雙鏈斷裂。圖4(a)還顯示，SC型和L型DNA隨劑量增加分別表現(xiàn)為單調(diào)遞減和遞增，而OC型則是先增后減，表明一部分已發(fā)生單鏈斷裂或其它單一損傷的DNA分子再次被自由基或質(zhì)子擊中而發(fā)生了二次或多次損傷，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂。

圖4(b)為加有600 mmol/L甘露醇的DNA樣品中三種分子形態(tài)隨劑量的變化，DNA分子也表現(xiàn)出相似的劑量響應(yīng)，即隨著劑量的變化DNA斷裂越來越嚴(yán)重，但主要以單鏈斷裂為主，僅在 650 Gy出現(xiàn)極少量的雙鏈斷裂，與圖4(a)相比，損傷程度遠(yuǎn)低于相同受照劑量未加甘露醇的DNA樣品。我們用γ射線和7Li離子輻照質(zhì)粒DNA時也觀察到類似現(xiàn)象[13?15]。與γ射線結(jié)果相比，在相同劑量下，質(zhì)子輻照后DNA樣品中的L型比例明顯較高，表明質(zhì)子具備更強的誘發(fā)雙鏈斷裂的能力，即具有較高的RBE。

由圖5(a)，對于未添加甘露醇的體系，100 Gy時每質(zhì)粒SSB數(shù)目已達(dá)2.2，更高劑量下，單鏈斷裂的DNA分子進(jìn)一步發(fā)生斷裂，完全轉(zhuǎn)化為雙鏈斷裂。而對于添加甘露醇的體系，在650 Gy時每質(zhì)粒的SSB數(shù)僅為0.8左右。

圖4 質(zhì)子輻照前后未添加(a)和添加了甘露醇(b)的DNA分子三種形態(tài)所占比例與劑量的關(guān)系Fig.4 Fraction of three forms of DNA solution without (a) or with mannitol (b) as function of. dose before and after protons irradiation.■ SC-type DNA, ● OC-type DNA, ▲ L-type DNA

由圖5(b)，添加甘露醇的DNA樣品中無明顯的雙鏈斷裂，650 Gy時每質(zhì)粒DSB為0.01，而未加甘露醇的DNA樣品中在300 Gy時就已達(dá)到2.3左右，劑量增至650 Gy，所有的DNA分子都發(fā)生了雙鏈斷裂。這些現(xiàn)象表明，加入高濃度的甘露醇后，由質(zhì)子輻解水而產(chǎn)生的˙OH主要與甘露醇分子反應(yīng)，溶液中自由˙OH大多被清除，與DNA分子反應(yīng)的有效˙OH較少，從而減少了DNA鏈斷裂損傷的發(fā)生，起到了保護(hù)DNA分子的作用。而未被抑制的 DNA單鏈斷裂，則主要由質(zhì)子直接攻擊DNA分子，將能量沉積在DNA鏈上使其發(fā)生斷裂而產(chǎn)生。

由圖 5(b)還可見，對于未添加甘露醇的 DNA溶液體系，每質(zhì)粒DSB數(shù)目與劑量有極好的線性-二次方關(guān)系，說明DNA雙鏈斷裂是能量沉積的單擊和雙擊事件的共同結(jié)果。未能被甘露醇清除的DSB主要由直接作用和局部多重?fù)p傷位點(LMDS)理論所述的刺團(tuán)(spur)內(nèi)˙OH引起，這與我們用質(zhì)子輻照加入紅景天苷的pUC19質(zhì)粒DNA實驗中觀察的結(jié)果相符[16]，進(jìn)一步表明質(zhì)子照射致DNA損傷中自由基作用占主導(dǎo)地位，而質(zhì)子的直接作用也不可忽視。

圖5 質(zhì)子輻照前后添加(●)和未添加(■)甘露醇的DNA樣品中每質(zhì)粒單鏈斷裂(a)和雙鏈斷裂(b)與劑量的響應(yīng)Fig.5 Dose responses of SSB (a) and DSB (b) per plasmid in DNA solution with (●) and without (■) mannitol before and after protons irradiation.

3 結(jié)語

質(zhì)子具有極強的誘發(fā)質(zhì)粒DNA損傷的能力，損傷程度與輻照劑量和DNA溶液濃度密切相關(guān)。甘露醇能清除輻射過程中產(chǎn)生的自由基，有效減少質(zhì)子誘發(fā)的DNA鏈斷裂的產(chǎn)生，具有一定的質(zhì)子輻射防護(hù)能力。甘露醇的保護(hù)作用及DNA溶液濃度對鏈斷裂產(chǎn)額的影響表明，在水溶液環(huán)境下，質(zhì)子輻射誘發(fā)的DNA鏈斷裂是直接作用和自由基間接作用的共同結(jié)果，而自由基的作用為主導(dǎo)因素。

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