韓莉莉,潘 棱,沈曉麗,林賽梅,林立芳,唐海燕,胡 潔
(福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院,福建省立醫(yī)院司法鑒定所,福建省心血管病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,福建 福州 350001)
目前,國(guó)內(nèi)外親子鑒定案例中多采用短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat,STR)基因座分型方法。正常情況下,單個(gè)STR基因座經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳圖譜分析表現(xiàn)為純合子個(gè)體只有一條帶或一個(gè)基因峰而雜合子有兩條帶或兩個(gè)基因峰,不會(huì)出現(xiàn)三條帶或三個(gè)基因峰的現(xiàn)象。本文在2 000個(gè)案例(共5 000名個(gè)體)親子鑒定或個(gè)體識(shí)別中,檢出3例4個(gè)個(gè)體三帶型等位基因并對(duì)其進(jìn)行遺傳學(xué)分析。
1.1 研究對(duì)象 本組4個(gè)三帶型基因個(gè)體均為日常檢驗(yàn)中檢出的突變案例。
1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 AmpFISTR?IdentifilerTM和SinofilerTMPCR擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)ABI公司),3130基因分析儀(美國(guó)ABI公司)。
1.3 方法
1.3.1 標(biāo)本采集 采集受檢者指血、外周靜脈肝素鋰抗凝血5 ml,室溫保存。
1.3.2 STR基因座檢測(cè) 采用Chelex-100法提取末梢血的DNA[1]。應(yīng)用AmpFISTR?IdentifilerTM和SinofilerTM試劑盒檢測(cè)Amelogenin基因及D8S1179等17個(gè)STR基因座,在ABI 3130基因分析儀上進(jìn)行熒光檢測(cè)分析。嚴(yán)格按照儀器和試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.3.3 染色體核型檢測(cè) 外周血細(xì)胞染色體核型檢測(cè)采用淋巴細(xì)胞培養(yǎng),常規(guī)制備染色體、G顯帶、鏡下計(jì)數(shù)及分析核型。
2.1 三帶型基因座檢測(cè)結(jié)果 3個(gè)案例4個(gè)個(gè)體中所有個(gè)體血樣DNA先用IdentifilerTM試劑進(jìn)行16個(gè)STR基因座的檢測(cè),其中分別在D3S1358基因座(1個(gè))、D13S317基因座(2個(gè))和D21S11基因座(1個(gè))檢出三帶型等位基因。進(jìn)一步用SinofilerTM試劑盒進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn),同樣進(jìn)行16個(gè)STR基因座的檢測(cè),其中三帶型等位基因座的檢測(cè)結(jié)果相同(見(jiàn)表1和圖1)。案例1中兒子的D3S1358基因型為16/17/18,峰高之比2:1:1;案例2中母親的D13S317基因型為8/13/14,兒子基因型為11/13/14,峰高之比約為1:1:1,其中母親等位基因13/14遺傳給了孩子;案例3中女兒D21S11基因型為28/29/31.2,峰高之比約為1:1:1,其中28/29來(lái)自母親。
2.2 染色體核型檢測(cè)結(jié)果 對(duì)外周血染色體核型進(jìn)行分析,父3的結(jié)果為46,XY,母2、母3的結(jié)果為46,XX,未見(jiàn)染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)明顯異常;而女3的染色體核型為47,XX,+21,染色體出現(xiàn)畸變現(xiàn)象(圖2)。
表1 3個(gè)案例中三帶型等位基因統(tǒng)計(jì)結(jié)果(n=5 000)
圖1 基因座檢測(cè)圖譜
圖2 女3的染色體核型分析圖
STR即短串聯(lián)重復(fù)序列(Short tandem repeat),是一類(lèi)廣泛存在于真核生物基因組中的DNA串聯(lián)重復(fù)序列。其核心序列為2~6個(gè)bp,重復(fù)次數(shù)通常為15~30次。由于STR基因座的個(gè)體識(shí)別概率和非父排除率高,PCR檢測(cè)所需檢材量少,靈敏度和成功率高,且適用于各種來(lái)源的生物性檢材,是目前國(guó)內(nèi)外法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親子鑒定的主要方法。根據(jù)孟德?tīng)栠z傳規(guī)律[2],孩子染色體上的遺傳基因,一半來(lái)自于其親生母親,一半來(lái)自于其親生父親,正常情況下不會(huì)出現(xiàn)3條帶型等位基因的現(xiàn)象,因此,親子鑒定中罕見(jiàn)三帶型等位基因的檢出。
本文三個(gè)案例中,有4位個(gè)體分別在D3S1358基因座、D13S317基因座和D21S11基因座檢出三帶型等位基因,并出現(xiàn)母子在D13S317基因座同為3條帶型等位基因的現(xiàn)象。檢驗(yàn)結(jié)果表明,D3S1358、D13S317和D21S11這3個(gè)基因座三帶型等位基因的信號(hào)強(qiáng)度、峰高和峰面積之比約為2:1:1或1:1:1。重復(fù)提取DNA,按不同試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(AmpFISTR?IdentifilerTM和SinofilerTM試劑盒)、毛細(xì)管電泳、分析,其檢驗(yàn)結(jié)果一致。說(shuō)明檢出的三帶型等位基因不是實(shí)驗(yàn)室的污染或電泳時(shí)泳道滲漏造成的假象,也不是PCR擴(kuò)增引起的非特異產(chǎn)物。
Crouse等[3]于1999年首次報(bào)道三帶型等位基因現(xiàn)象,發(fā)現(xiàn)18例TPOX基因座及1例CSF1PO基因座出現(xiàn)三帶型等位基因的個(gè)體,其信號(hào)強(qiáng)度、峰高和峰面積接近。Rubocki等[4]檢測(cè)的一個(gè)個(gè)體9個(gè)基因座中有4個(gè)基因座(vWA、FGA、TH01、D5S818)都表現(xiàn)為三帶型等位基因,且有2條“主帶”(熒光強(qiáng)度高)、1條“次帶”(熒光強(qiáng)度低)。后得知該個(gè)體有一個(gè)雙胞胎兄弟,推測(cè)可能在子宮內(nèi)胚胎間發(fā)生血液交換導(dǎo)致三帶型等位基因的出現(xiàn)。黃雅燕等[5]報(bào)道在親子鑒定案件中檢出了3個(gè)個(gè)體在DYS385基因座出現(xiàn)三帶型等位基因。李坤明[6]檢出D3S1358基因座出現(xiàn)三帶現(xiàn)象。賴(lài)力等[7]在日常檢案中檢出了1例D18S51的三帶型等位基因。目前在STR數(shù)據(jù)庫(kù)中(http://www.cstl.nist.gov/biotech/strbase)共收錄了198例21個(gè)STR基因座的三帶型等位基因資料(包括Cordis系統(tǒng)的13個(gè)常染色體STR、Penta D、Penta E、D2S1338、D19S433、FES/FPS、D10S1248、D12S391和DYS456),隨著應(yīng)用的拓展和研究的不斷深入,還可能發(fā)現(xiàn)新的STR三帶型等位基因。本文D13S317基因座的三帶型等位基因現(xiàn)象屬?lài)?guó)內(nèi)首例報(bào)道。
目前三帶型等位基因產(chǎn)生的確切機(jī)制尚不十分明確,可能的機(jī)制有以下幾方面:一是父系或母系同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)不分離而整體遺傳給子代,即三體綜合征。案例3中的女兒在D21S11基因座檢出28/29/31.2三帶型,其額外染色體來(lái)自母親,染色體核型分析和臨床診斷證實(shí)符合21三體綜合征。二是同源染色體在減數(shù)分裂時(shí)出現(xiàn)不等價(jià)交換。在案例2中孩子的13/14等位基因來(lái)自母親,對(duì)母親進(jìn)行外周血染色體核型分析,未見(jiàn)染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目明顯異常,推測(cè)該例的三帶型等位基因可能由此原因所致。其子因血量不夠未能進(jìn)行染色體核型分析,但母子二人均缺失染色體病變的臨床癥狀,且母子二人均出現(xiàn)三帶型等位基因者更為罕見(jiàn)。三是在受精卵發(fā)育階段,染色體不分離產(chǎn)生不同基因型細(xì)胞組成的嵌合體。四是雙胞胎在胚胎發(fā)育期間發(fā)生血液交換。五是異基因骨髓或造血干細(xì)胞移植后形成的嵌合體,形成三或四帶等位基因。上述原因均可導(dǎo)致在檢測(cè)STR基因座時(shí)出現(xiàn)三帶型等位基因現(xiàn)象。
三帶型等位基因現(xiàn)象在親子鑒定檢案中極為少見(jiàn),若在基因分型時(shí)出現(xiàn)此現(xiàn)象需引起重視。首先應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn),包括標(biāo)本提取、PCR擴(kuò)增和電泳分析等過(guò)程,以排除模板污染和泳道滲漏等問(wèn)題,然后再選用其他試劑盒進(jìn)行驗(yàn)證。若的確為三帶型等位基因,應(yīng)加做其他STR基因座,以保證鑒定結(jié)論的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性。如有可能建議進(jìn)行染色體核型分析,以利于優(yōu)生優(yōu)育。
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[5]黃雅燕,張 毅,張曉紅.DYS385基因座檢出三帶型等位基因三例[J].廣東公安科技,2007,22(2):73-74.
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[7]賴(lài) 力,薛士杰,何 萍.D18S51基因座檢出三帶型等位基因1例及遺傳分析[J].福建醫(yī)藥雜志,2008,30(6):85-86.