黃 琳 蔣宗勇 林映才 周桂蓮 鄭春田 陳 芳

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是人類和動(dòng)物范圍內(nèi)極為廣泛的綜合病癥的主要原因之一,這些綜合病癥包括腸炎、腸蠕動(dòng)紊亂、各種急性炎癥等。氧化應(yīng)激過程中產(chǎn)生的大量活性氧和活性氮可通過細(xì)胞脂質(zhì)過氧化、損傷 DNA分子、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因等途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,引起組織損傷[1]。試驗(yàn)證明,氧化魚油將會(huì)引起體內(nèi)產(chǎn)生氧化應(yīng)激[2-7],同時(shí)氧化應(yīng)激可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能下降[8],然而腸道氧化應(yīng)激與免疫應(yīng)答之間的相互關(guān)系尚未完全闡明?，F(xiàn)有研究表明氧化應(yīng)激產(chǎn)物活性氧簇(ROS)是炎癥和免疫活化的重要信號(hào)分子[9],ROS可對(duì)腸道黏膜免疫系統(tǒng)造成損害。在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的通路中,NF-κB-iNOSNO通路是一條關(guān)鍵通路[10],搞清楚這條通路在腸道中是否存在,又是如何調(diào)控腸道中的細(xì)胞因子,這些問題正是本研究的目的所在。大豆異黃酮(soybean isoflavone,SI)是一類從大豆中提取的、具有多酚羥基結(jié)構(gòu)的生物活性物質(zhì),具有抗氧化作用[11]。本研究在人工飼養(yǎng)條件下,通過添加外源性氧化魚油以及 SI,研究氧化應(yīng)激對(duì)新生仔豬生長性能、小腸黏膜中相關(guān)酶活性的影響,旨在探討氧化應(yīng)激對(duì)新生仔豬生長、小腸黏膜發(fā)育以及腸道免疫機(jī)制以及 SI對(duì)其的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

本試驗(yàn)選用 4日齡體重為(1.9±0.1)kg的同性別杜 ×長 ×大三元雜交新生仔豬 96頭(從母豬胎次一致、產(chǎn)期相同的 20窩中選取),按窩別和體重隨機(jī)分成 4個(gè)組,每組 6個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)4頭。

1.2 試驗(yàn)材料

SI為廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所研制,含量為 98.5%。魚油為精煉飼用魚油,購于廣州永興濃縮飼料有限公司,購進(jìn)時(shí)放入冷庫中保存。

1.3 試驗(yàn)處理及氧化應(yīng)激模型的建立

試驗(yàn)采用 2(新鮮和氧化魚油)×2(未添加和添加 50 mg/kg SI)雙因子隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表 1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design

1.4 試驗(yàn)飼糧

試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧根據(jù) NRC(1998)中 3～5 kg仔豬的飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)配制,基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表 1,試驗(yàn)組中的氧化魚油為人工自制。對(duì)照組(Ⅰ組 )、Ⅱ組、Ⅲ組添加 Fe2+、Cu2+與 Ⅳ組的Fe2+、Cu2+達(dá)到平衡。氧化魚油的制作方法參考John等[2]并做一定的修改,按比例添加 30 mg/kg Fe2+(以 FeSO4?7H2O形式添加)、15 mg/kg Cu2+(以 CuSO4? 5H2O形式添加)、600 mg/kg H2O2和 0.3%的水,充分混合后,(60±1)℃條件下攪拌氧化,同時(shí)不間斷的通入一定流量的空氣,分不同的時(shí)間段采樣,測(cè)定魚油中的過氧化物價(jià)(POV),即油脂氧化形成的過氧化產(chǎn)物氧化碘化鉀成為游離碘的量。制取一定過氧化程度的氧化魚油。氧化魚油制好后放入 -20℃冷庫中凍存待用。

1.5 飼養(yǎng)管理

仔豬 4日齡斷奶時(shí)稱個(gè)體重,分組。每個(gè)代謝籠中飼養(yǎng) 4頭仔豬,通過用保溫?zé)艉捅貕|控制各飼養(yǎng)籠溫度在(30±1)℃。將飼糧干料與溫開水以 1∶4兌成液態(tài)乳樣,飼喂當(dāng)天配制成新鮮液態(tài)飼料,裝進(jìn)特制料槽進(jìn)行飼喂。每天按仔豬體重的 30%飼喂。每次飼喂后換上裝有溫開水的料槽供仔豬自由飲水,換下的料槽用溫水清洗,飼喂時(shí)間為 07:30、10:00、12:30、15:00、15:30、22:00喂至仔豬 24日齡,試驗(yàn)期為 21 d。

1.6 樣品采集和指標(biāo)測(cè)定

試驗(yàn)仔豬于 14日齡時(shí)稱重 1次,然后于 24日齡時(shí)晚上空腹 16 h后,于次日早上個(gè)體稱重,計(jì)算各階段及全期平均日增重;記錄耗料量,計(jì)算各階段及全期料重比。取每個(gè)重復(fù)中的 2頭仔豬共 48頭進(jìn)行屠宰取樣。

取十二指腸、空腸和回腸中上段約 10 cm,在4℃條件下用磷酸緩沖液(PBS)洗凈腸道內(nèi)容物,用濾紙輕輕吸干,用玻片小心刮取黏膜分裝于 Eppendorf管內(nèi),-80℃保存?zhèn)溆谩Ｄc道黏膜總超氧化物歧化酶(T-SOD)、過氧化氫酶(CAT)、肌酸激酶(CK)活性、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量采用南京建成生物公司分析試劑盒用紫外可見分光光度計(jì)(BioMate 5,Thermo Scientific,USA)測(cè)定。腫瘤壞死因子 -α(TNF-α)、白細(xì)胞介素 -2(IL-2)、白細(xì)胞介素 -6(IL-6)、白細(xì)胞介素 -8(IL-8)、白細(xì)胞介素 -10(IL-10)、核因子 -κB(NF-κB)含量,誘導(dǎo)性一氧化氮合成酶(iNOS)、應(yīng)激激活蛋白激酶(JNK)、激活蛋白 -1(AP-1)活性采用 ELISA測(cè)定,相應(yīng)試劑盒購自美國 R＆D公司。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SAS軟件(v6.12,SAS Institute,USA)的 GLM程序進(jìn)行方差分析并用 Duncan氏法進(jìn)行多重比較。統(tǒng)計(jì)模型包括:氧化魚油效應(yīng)、SI效應(yīng)以及二者的互作效應(yīng)。統(tǒng)計(jì)顯著性水平為 P＜0.05,極顯著性水平為 P＜0.01。各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié) 果

2.1 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬生產(chǎn)性能的影響

由表 3可知,魚油氧化處理對(duì)試驗(yàn) 1～21 d仔豬平均日增重和 1～21 d料重比均產(chǎn)生顯著影響(P＜0.05),SI處理對(duì)試驗(yàn) 1～21 d仔豬料重比有影響的趨勢(shì)(P=0.058)。

2.2 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬腸道黏膜抗氧化能力的影響

由表 4可知,Ⅱ組和Ⅲ組腸道黏膜 T-AOC顯著低于Ⅰ組和Ⅳ組(P＜0.05)。魚油氧化處理對(duì)CK活性略有提高(P=0.054)。SI處理顯著提高SOD活性(P＜0.05)。氧化魚油和 SI對(duì) T-AOC產(chǎn)生極顯著互作效應(yīng)(P＜0.01)。

2.3 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬空腸黏膜 MDA含量的影響

由表 5可知,新生仔豬飼糧魚油氧化處理極顯著提高了空腸黏膜 MDA含量(P＜0.01)。Ⅲ組仔豬腸道黏膜 MDA含量比Ⅰ組和Ⅱ組分別提高了 90.89%(P＜0.05)和 73.28%(P＜0.05)。

2.4 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬腸道黏膜免疫因子的影響

由表 6可以得出,Ⅳ組腸道黏膜 IL-10含量極顯著低于Ⅲ組(P＜0.01);Ⅲ組和Ⅳ組腸道黏膜IL-10含量極顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組(P＜0.01)。魚油氧化處理極顯著提高新生仔豬腸道黏膜 IL-2含量(P＜0.01),極顯著降低 IL-10含量 (P＜0.01),顯著降低腸道 IL-8含量(P＜0.05)。SI處理極顯著提高了腸道黏膜 IL-10的含量(P＜0.01)。氧化魚油和 SI對(duì) IL-10含量產(chǎn)生極顯著互作效應(yīng)(P＜0.01)。

表3 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬生產(chǎn)性能的影響Table 3 Effects of SI supplementation on the performance of neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

表4 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬空腸黏膜抗氧化能力的影響Table 4 Effects of SI supplementation on the ability of antioxidation in jejunum mucosa of neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

表5 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬空腸黏膜 MDA含量的影響Table 5 Effects of SI supplementation on the content of MDA in jejunum mucosa of neonatal piglets fed oxidized and fresh fish oil diets

表6 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加SI對(duì)新生仔豬空腸黏膜細(xì)胞免疫因子的影響Table 6 Effects of SI supplementation on the cell-mediated immunologic factors of jejunum mucosa in neonatal piglets fed fresh and oxidized fish oil diets

2.5 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加 SI對(duì)新生仔豬腸道黏膜免疫和氧化相關(guān)因子的影響

由表 7可以得出,Ⅲ組對(duì)新生仔豬腸道黏膜NF-κB含量的影響極顯著高于Ⅰ組(P＜0.01),顯著高于Ⅳ組(P＜0.05)。魚油氧化處理顯著提高了腸道黏膜 iNOS活性(P＜0.05),對(duì) NF-κB含量略有升高(P=0.08)。氧化魚油和 SI對(duì)腸道黏膜NF-κB含量產(chǎn)生顯著互作效應(yīng)(P＜0.01),對(duì) AP-1含量略有互作效應(yīng)(P=0.098)。

3 討 論

研究表明給試驗(yàn)動(dòng)物飼喂氧化魚油可使動(dòng)物機(jī)體 ROS大量產(chǎn)生,MDA含量增加,體內(nèi) T-SOD降低,誘導(dǎo)氧化應(yīng)激[2-7]。本試驗(yàn)給新生仔豬飼糧中添加氧化魚油,建立新生仔豬腸道氧化應(yīng)激模型,從試驗(yàn)結(jié)果中得出,飼糧中添加氧化魚油對(duì)新生仔豬腸道 T-SOD、CK活性、T-AOC以及 MDA含量有顯著變化,這說明本試驗(yàn)添加氧化魚油組成功建立了新生仔豬腸道氧化應(yīng)激模型。SI可抑制自由基的產(chǎn)生和清除自由基,可誘導(dǎo)增強(qiáng)內(nèi)源抗氧化酶活性,如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、CAT等,可增加金屬硫蛋白 (MT)的合成。SI的抗氧化作用已引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[12-17]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,給人工飼養(yǎng)的 4日齡斷奶仔豬代乳料中添加氧化魚油后,飼喂 SI表現(xiàn)出不同的生長速度,在氧化應(yīng)激情況下,飼糧添加 SI仔豬料重比和無應(yīng)激下飼喂基礎(chǔ)飼糧仔豬的料重比相比較,飼糧添加 SI有補(bǔ)償仔豬飼喂氧化魚油后引起的生長不良反應(yīng)。

表7 新鮮魚油和氧化魚油飼糧中添加SI對(duì)新生仔豬腸道氧化相關(guān)因子和黏膜免疫的影響Table 7 Effects of SI supplementation on the Co-oxidation and immune-related factors of jejunum mucosa in neonatal piglets fed oxidized and fresh fish oil diets

IL-10具有抗炎和抑制多種細(xì)胞因子合成的作用,主要抑制 Th1細(xì)胞的激活和細(xì)胞因子的產(chǎn)生,其生物學(xué)功能主要是抑制和終止炎癥反應(yīng),并且IL-10具有很強(qiáng)的抑制巨噬細(xì)胞活性的作用[18],有研究表明長期的高脂膳食可導(dǎo)致機(jī)體形成亞臨床狀態(tài)的炎癥狀態(tài),這種低度的炎性狀態(tài)與代謝綜合癥有密切的關(guān)系[19]。Deng等[8]的研究表明,對(duì)斷奶仔豬用注射敵草快誘導(dǎo)氧化應(yīng)激模型后,仔豬血液中白細(xì)胞介素 -1(IL-1)和干擾素 -γ(IFN-γ)增加,說明機(jī)體免疫功能發(fā)生改變。在本實(shí)驗(yàn)中,飼喂氧化魚油組仔豬腸道黏膜中 IL-2水平顯著增高,IL-8和 IL-10下降,證明了氧化魚油誘導(dǎo)的腸道氧化應(yīng)激導(dǎo)致了炎癥反應(yīng),使動(dòng)物的免疫機(jī)制發(fā)生改變。

NF-κB是由 NF-κB/Rel蛋白家族的 2個(gè)亞基組成的二聚體蛋白質(zhì),幾乎存在于所有細(xì)胞中在正常情況下,細(xì)胞內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子 κB結(jié)合成復(fù)合物,當(dāng)細(xì)胞受到自由基作用,在氧化應(yīng)激狀態(tài)下,NF-κB從復(fù)合體中解離并向核內(nèi)移動(dòng),與位于核內(nèi)的基因序列上特異性調(diào)控區(qū)結(jié)合,從而激活受調(diào)控的基因表達(dá)[20]。因此,測(cè)定 NF-κB在細(xì)胞中的變化,可反映出細(xì)胞在自由基作用的程度。本研究中,與炎癥反應(yīng)相關(guān)的 2個(gè)基因表達(dá)水平升高,其中 NF-κB表達(dá)水平顯著上調(diào),說明氧化魚油誘導(dǎo)的腸道氧化應(yīng)激可使機(jī)體生成過多的 ROS,ROS可通過激活氧化還原狀態(tài)敏感的轉(zhuǎn)錄因子 NF-κB來促進(jìn)前炎性細(xì)胞因子的表達(dá),加劇炎癥反應(yīng)。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明,SI可下調(diào) NF-κB的表達(dá)水平,說明 SI能通過清除過多的自由基來恢復(fù)機(jī)體氧化還原狀態(tài)。從本試驗(yàn)的研究中還可以得出腸道氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷通路是通過 NF-κB-iNOS-NO進(jìn)行的。

4 結(jié) 論

給新生仔豬飼喂氧化魚油飼糧造成了仔豬腸道氧化應(yīng)激,誘發(fā)了腸道炎癥反應(yīng),添加 SI能在一定程度上改善飼喂氧化魚油誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激狀態(tài),從而緩解炎癥的發(fā)生,增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力。

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