沈文英 李衛(wèi)芬 梁 權(quán) 鄧 斌 陳南南 周緒霞

我國水產(chǎn)養(yǎng)殖的集約化發(fā)展導(dǎo)致水環(huán)境日益惡化,病害頻繁發(fā)生,直接影響?zhàn)B殖動物的生長發(fā)育,甚至導(dǎo)致養(yǎng)殖動物的大量死亡。益生菌因其安全性好且具有促進(jìn)動物生長和改善水質(zhì)等功能而被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中[1]。研究表明,益生菌的促生長機(jī)理主要與改善水體水質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高機(jī)體免疫和抗氧化功能有關(guān)[2-5]。益生菌作為飼料添加劑可以促進(jìn)魚類免疫器官的成熟[6]、刺激呼吸爆發(fā)活性[7]、提高免疫和抗氧化能力[8-10],從而提高其抗病力和促進(jìn)生長。研究表明,益生菌芽孢桿菌能提高鯽魚[11]、南美白對蝦[1-2,10]的消化酶活力和免疫能力。而有關(guān)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對魚類免疫和抗氧化功能的研究較少。因此,本試驗擬在草魚(Ctenopharyngodon idellus)飼料中添加枯草芽孢桿菌,探討其對草魚生長性能、免疫和抗氧化功能的影響,為枯草芽孢桿菌在草魚養(yǎng)殖中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗用枯草芽孢桿菌制劑由本實驗室制備,枯草芽孢桿菌含量為 1×108CFU/g。根據(jù)草魚配合飼料營養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)(SC/T 1024—1997)配制基礎(chǔ)飼料,基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平見表 1。根據(jù)預(yù)試驗并結(jié)合參考文獻(xiàn)[10],在基礎(chǔ)飼料中添加 1‰枯草芽孢桿菌制劑,使得試驗飼料中枯草芽孢桿菌含量達(dá)到 1×105CFU/g。

表1 基礎(chǔ)飼料組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗用草魚由浙江省紹興市淡水養(yǎng)殖場提供,在試驗前先馴養(yǎng) 1周,然后選取體重(51.0±2.3)g的健康無病草魚 300尾,隨機(jī)分成 2組(對照組和試驗組),每組 3個重復(fù),每個重復(fù) 50尾魚。對照組飼喂基礎(chǔ)飼料,試驗組飼喂試驗飼料(含枯草芽孢桿菌 1×105CFU/g)。按草魚體重3%的日投餌量飼喂,每天分 3次(08:00、12:00和19:00)投餌,試驗期為 45 d。試驗在室內(nèi)過濾式循環(huán)水系統(tǒng)中進(jìn)行,試驗魚以重復(fù)為單位飼養(yǎng)于圓形水族箱(體積為 2.75 m3,實際水體積為1.33 m3)內(nèi),試驗用水為充分曝氣的水庫水,每周換水 1/3。試驗期間水溫為 18～25℃,用ACO-318型空氣壓縮機(jī) 24 h增氧。

1.3 樣品采集

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后,停飼 24 h,從每個重復(fù)隨機(jī)抽取 10尾魚,以 0.2 g/L的 3-氨基苯甲酸乙酯甲基磺酸鹽麻醉后取樣。

血清樣品:通過尾椎靜脈采血,將血樣在 4℃冰箱中靜置 24 h后,4℃4 000 r/min離心15 min,取上清液于 1.5 mL Eppendorf管中,立即保存于-80℃冰箱中備用。

肝胰臟樣品:將每尾魚的肝胰臟裝于密封樣品袋中,立即用液氮快速冷凍,然后轉(zhuǎn)至 -80℃冰箱中保存。準(zhǔn)確稱取 0.5 g草魚肝胰臟樣品于滅菌的 10 mL離心管中,加 4.5 mL預(yù)冷滅菌的生理鹽水,然后用自動勻漿器于冰上勻漿,得 10%組織勻漿液。將 10%組織勻漿液于 4℃ 4 000 r/min離心 20 min,取上清液于 1.5 mL Eppendorf管中,立即保存于 -80℃冰箱中備用。

1.4 指標(biāo)測定與方法

1.4.1 生長性能

在養(yǎng)殖試驗開始和結(jié)束時分別對草魚進(jìn)行稱重,計算增重率(WGR)和特定生長率(SGR),公式如下:

WGR(%)=100×(終末體重 -初始體重)/初始體重;

SGR(%/d)=100×(ln終末體重 -ln初始體重)/試驗天數(shù)。

1.4.2 血清免疫指標(biāo)

血清總蛋白和白蛋白含量分別采用考馬斯亮藍(lán) G-250染料法和溴甲酚綠法測定,球蛋白含量即為總蛋白含量減去白蛋白含量。血清溶菌酶(LZM)活性采用比濁法測定,髓過氧化物酶(MPO)活性采用比色法測定,堿性磷酸酶(AKP)活性采用磷酸苯二鈉法測定,谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性均采用賴氏法測定。血清補(bǔ)體 3(C3)和免疫球蛋白 M(IgM)含量分別采用速率散射濁度法和免疫透射比濁法測定。血清總蛋白、白蛋白含量以及 LZM、MPO、AKP、GOT和 GPT活性的測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,而血清 C3和 IgM含量的測定所用試劑盒購自寧波慈城生化試劑廠。

1.4.3 血清和肝胰臟抗氧化指標(biāo)

血清和肝胰臟中超氧化物歧化酶(SOD)活性采用鄰苯三酚自氧化法測定,過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外吸收法測定,谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和還原型谷胱甘肽(GSH)含量均采用 5,5-二巰基雙 -2-硝基苯甲酸(DTNB)法測定,抗超氧陰離子自由基(O-2?)活性采用鄰苯三酚自氧化法測定,丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法測定,總抗氧化能力(T-AOC)采用比色法測定。血清和肝胰臟中 SOD、CAT、GSH-Px、抗 O-2?活性,GSH、MDA含量以及 TAOC的測定所用試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用 Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)均以平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行配對 t檢驗分析,P＜0.05表示存在顯著差異。

2 結(jié) 果

2.1 飼料中添加芽孢桿菌對草魚生長性能的影響

由表 2可見,與對照組相比,試驗組草魚的WGR提高了 21.78%,SGR提高了 16.67%,差異達(dá)到顯著水平(P＜0.05)。

表2 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚生長性能的影響Table 2 Effects of dietary Bacillus subtilis on growth performance of grass carp

2.2 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚免疫功能的影響

由表 3可知,與對照組相比,試驗組草魚血清中 IgM、C3含量和 AKP活性顯著升高(P＜0.05),而 MPO和 GPT活性則顯著降低 (P＜0.05)。飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白含量,白球比以及 LZM和GOT活性無顯著影響(P＞0.05)。

表3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚血清免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of dietary Bacillus subtilis on serum immune indices of grass carp

2.3 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚抗氧化功能的影響

由表 4可知,與對照組相比,試驗組草魚血清和肝胰臟中 T-AOC以及 CAT、SOD活性和肝胰臟GSH含量顯著升高(P＜0.05),血清 T-AOC以及CAT、SOD活性分別提高了 18.31%、44.23%和11.01%,肝胰臟 T-AOC,CAT、SOD活性和 GSH含量分別提高了 37.60%、52.00%、39.05%和51.39%;血清和肝胰臟中抗 O-2?活性和 MDA含量均顯著降低(P＜0.05),抗 O-2?活性分別降低了 21.73%和 25.97%,MDA含量分別降低了48.62%和 12.62%。飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚血清和肝胰臟中 GSH-Px活性以及血清中GSH含量無顯著影響(P＞0.05)。

表4 飼料中添加枯草芽孢桿菌對草魚血清和肝胰臟抗氧化指標(biāo)的影響Table 4 Effects of dietary Bacillus subtilis on antioxidant indices in serum and hepatopancreas of grass carp

3 討 論

益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用的研究主要集中于改善水質(zhì)和促進(jìn)水產(chǎn)動物生長方面[2-5],而對水產(chǎn)動物自身免疫和抗氧化功能影響的報道較少。研究表明,枯草芽孢桿菌投喂鯉魚能顯著提高鯉魚的巨噬細(xì)胞呼吸爆發(fā)活力和抗嗜水氣單胞菌的能力,促進(jìn)鯉魚免疫器官的成熟[6]。枯草芽孢桿菌和乳酸菌單獨或復(fù)合投喂能提高金頭海鯛(Sparus aurata)非特異性免疫力[8]。鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)可刺激虹鱒魚(Oncorhynchus mykiss)巨噬細(xì)胞的呼吸爆發(fā)活力[7]。本試驗結(jié)果顯示,飼料中添加枯草芽孢桿菌能顯著提高草魚的 WGR和 SGR,提高草魚血清中 IgM、C3含量和AKP活性。這說明飼料中添加枯草芽孢桿菌可以提高草魚部分特異性和非特異免疫功能。飼料中添加芽孢桿菌等益生菌增強(qiáng)動物機(jī)體免疫功能的機(jī)理可能是通過改善水生動物腸道微生態(tài)環(huán)境和通過自身分泌免疫激活劑來實現(xiàn)的[12-15],芽孢桿菌通過口服作用于腸道集合淋巴結(jié)的抗原結(jié)合位點或通過調(diào)整動物的微生物群間接地發(fā)揮免疫賦活的作用,提高機(jī)體的局部或整體防御功能,進(jìn)而起到防病、抗病的作用[16]。此外,本試驗還檢測了草魚血清 GPT和 GOT活性,發(fā)現(xiàn)試驗組草魚血清GPT和 GOT活性均低于對照組,這與朱學(xué)芝等[17]在凡納濱對蝦上得到的結(jié)果一致,表明枯草芽孢桿菌對草魚的肝胰臟功能無損傷。

本試驗結(jié)果顯示,飼料中添加枯草芽孢桿菌可通過提高血清和肝胰臟中的相關(guān)抗氧化物的活性或含量來增強(qiáng)草魚血清和肝胰臟的抗氧化功能,具體表現(xiàn)為草魚血清中 T-AOC,CAT、SOD活性和肝胰臟中 T-AOC,CAT、SOD活性和 GSH含量顯著提高,血清和肝胰臟中抗 O-2?活性和MDA含量顯著降低。這與前人得出的地衣芽孢桿菌提高三角帆蚌[9]和枯草芽孢桿菌提高凡納濱對蝦[10]抗氧化功能的結(jié)果一致。研究表明,芽孢桿菌和乳酸菌均具有清除機(jī)體羥自由基、CAT以及抗脂質(zhì)過氧化的能力[9-10,18]。大多數(shù)乳酸菌通過提高 SOD活性和 GSH含量來抵抗機(jī)體的氧化[19-20],而枯草芽孢桿菌隨飼料進(jìn)入魚體后也可能通過自身分泌抗氧化酶或者作為激活劑促進(jìn)機(jī)體抗氧化酶分泌,從而有效清除自由基,阻止脂質(zhì)過氧化。因此在飼料中添加適量枯草芽孢桿菌可以提高草魚的免疫和抗氧化功能,減輕自由基對機(jī)體的損傷,減少草魚養(yǎng)殖過程中的病害發(fā)生。這也是枯草芽孢桿菌作為飼料添加劑促進(jìn)草魚生長的原因之一。

4 結(jié) 論

①飼料中添加枯草芽孢桿菌可促進(jìn)草魚的生長。

②飼料中添加枯草芽孢桿菌可提高草魚的部分特異性和非特異免疫功能,且對其肝胰臟功能無不良影響。

③飼料中添加枯草芽孢桿菌可提高草魚的抗氧化功能,進(jìn)而減輕自由基對機(jī)體的損傷。

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