許丹丹 黃燕華 曹俊明 藍漢冰 王國霞 張榮斌,3 陳曉瑛 嚴 晶,3

凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)因其具有抗逆能力強、生長速度快、飼料轉(zhuǎn)化效率和加工出肉率高等諸多優(yōu)點,已成為世界三大對蝦養(yǎng)殖品種之一。近年來,由于養(yǎng)殖環(huán)境惡化,非傳染性疾病和傳染性疾病滋生等一系列問題,造成養(yǎng)殖對蝦機體氧化損傷嚴重,免疫力下降,生長速度降低甚至死亡[1-3]。目前,許多學者開始把注意力轉(zhuǎn)移到對蝦免疫能力的營養(yǎng)調(diào)控方面,并越來越重視提高蝦類自身的抗病及抗應激能力。一般認為,甲殼動物的免疫主要為非特異性免疫,主要包括血細胞的吞噬、包掩[4]以及血淋巴中的各種因子或酶等的殺菌、抗菌作用[5-6]。核苷酸是組成細胞的主要成分,是 DNA和 RNA的基本組成單位,在生物體內(nèi)具有信息編碼、調(diào)節(jié)代謝、傳遞信號、作為輔酶等重要的生理和生化功能[7]。近年來,對小鼠[8-9]及人[10-11]的研究表明,機體許多代謝旺盛的組織(小腸、大腸、淋巴)和細胞(紅細胞、白細胞、骨髓細胞)從頭合成核苷酸的能力有限,需要補充外源核苷酸。對哺乳動物及畜禽的研究表明,飼料核苷酸可以加快動物的生長速度,提高動物的生產(chǎn)性能[12-13],增強巨噬細胞的吞噬作用[14-15]以及強化自然殺傷細胞的活性[16]。Li等[17]和 Devresse[18]分別綜述了核苷酸在魚類和蝦類的研究現(xiàn)狀,表明外源核苷酸可以促進魚類和蝦類生長,并影響先天免疫系統(tǒng)的激素分泌和細胞組成,增強免疫因子在應激時快速增長和快速應答的能力。核苷酸自身的堿性氮原子可以捕捉機體氧化過程中形成的自由基,具有保護血細胞膜脂質(zhì)過氧化物及由過氧化損傷造成的紅細胞破裂作用[19]。本研究室前期試驗結(jié)果顯示,飼料中添加一定量的鳥苷酸鈉鹽可在一定程度上提高凡納濱對蝦的增重率、體蛋白質(zhì)及脂肪的含量以及血清和肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC)和超氧化物歧化酶(SOD)活性[20]。飼料中添加一定量的核苷酸粗提物能顯著提高凡納濱對蝦的增重率,降低飼料系數(shù),提高全蝦粗蛋白質(zhì)和粗脂肪含量[21]。為進一步了解核苷酸對凡納濱對蝦非特異性免疫及抗氧化能力的作用,本試驗擬在飼料中添加不同水平的核苷酸混合物,觀察其對凡納濱對蝦幼蝦血清、肝胰腺非特異性免疫及抗氧化相關(guān)指標的影響,以便為核苷酸在凡納濱對蝦飼料中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 核苷酸混合物

5′-胞苷酸、5′-腺苷酸、5′-尿苷酸二鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉均由南京同凱兆業(yè)生物技術(shù)有限責任公司提供,純度均大于 99%。核苷酸混合物由上述 5種核苷酸按照質(zhì)量比1∶1∶1∶1∶1的比例混勻后制得 。

1.2 試驗飼料

以魚粉、酪蛋白、大豆?jié)饪s蛋白為主要蛋白質(zhì)源,魚油為主要脂肪源,高筋面粉為主要糖源,配制蛋白質(zhì)和脂肪水平分別為 43.37%和 10.41%的基礎飼料[20-23],其組成及營養(yǎng)水平見表 1。在基礎飼料中分別添加 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/kg的核苷酸混合物,配制成 8種試驗飼料 ,分別記 為 G0、G0.1、G0.2、G0.4、G0.6、G0.8、G1.0、G1.2。飼料原料粉碎后過 60目篩,微量成分采取逐級擴大法添加,核苷酸混合物先溶于水,然后混入飼料中。所有原料全部混合均勻后用 SLX-80型雙螺桿擠壓機制成直徑為1.0 mm的顆粒料,在 55℃下烘干,冷卻后放入密封袋中于 -20℃冰箱中保存待用。

表1 基礎飼料組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.3 試驗動物與飼養(yǎng)管理

凡納濱對蝦購自珠海斗門蝦苗場,飼養(yǎng)試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所水產(chǎn)研究中心室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進行。試驗水源為經(jīng)沙濾、消毒后的天然海水與自來水混合后的咸淡水,鹽度為4.5‰～5.5‰,玻璃纖維桶容積為 350 L(直徑80 cm,高 70 cm,水體容積 300 L),進水速率為1.4 L/min。試驗期間以自然光為光源,光周期為自然光周期,水溫 25～30℃,pH 7.7～8.0,溶氧 ＞5 mg/L,氨氮≤0.02 mg/L,亞硝酸鹽≤0.2 mg/L。試驗蝦先在室外循環(huán)水泥池中用蝦苗場的幼蝦飼料將蝦苗培育至 0.43 g左右。試驗時選擇 960尾對蝦,隨機分成 8組(每組設 3個重復,每個重復 40尾蝦),分別投喂 1種試驗飼料,養(yǎng)殖期為 5周。采用飽食投喂法,每天分別在 8:00、15:00和 20:00分 3次投喂,投飼后 30 min吸出殘餌,同時根據(jù)攝食情況及時調(diào)整投飼量。每天觀察對蝦健康狀況,記錄死亡情況。

1.4 樣品采集與測定

試驗結(jié)束時,禁食 24 h,每個重復隨機取 15尾蝦,用 1 mL無菌注射器插入心臟取血,合并置于無菌 Eppendorf管中,4℃冰箱靜置過夜后10 000 r/min離心 10 min,移出血清分裝,于 -20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每個重復隨機取 5尾蝦,分別剝離肝胰腺和肌肉,置于無菌 Eppendorf管中,于 -80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。分別稱取 0.3 g左右肝胰腺和肌肉,剪碎,放入玻璃勻漿器中,按 1∶9的體積比加入生理鹽水勻漿,制成 10%肝胰腺勻漿液和肌肉勻漿液,在4℃下 3 000 r/min離心 10 min,取上清液,分裝后于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活測定:血清和肝胰腺中總抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、堿性磷酸酶(AKP)活性和丙二醛(MDA)含量以及肌肉中抗超氧陰離子自由基(O-2?)活性采用南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定,具體測定方法按照試劑盒的說明進行。

血細胞計數(shù):每個重復隨機取 5尾蝦,用 1 mL無菌注射器插入心臟取血,合并置于無菌 Eppendorf管中。吸取 150μL抗凝劑[參照 Franciso等[24]的方法配制,具體方法如下:NaCl 2.628 0 g、KCl 0.074 5 g、EDTA-Na 0.372 2 g、羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HEPES)0.238 3 g,蒸餾水定容至 100 mL]于無菌 Eppendorf管中,注入凡納濱對蝦血液 100μL,迅速混勻,制備抗凝血。取 50μL抗凝血,加入 10 mL pH為 7.3的 PBS緩沖液進行 500倍稀釋,用細胞計數(shù)儀(Z2coulter,BECKMAN COULTER)進行計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

結(jié)果以平均值 ±標準差表示,數(shù)據(jù)采用 SPSS 16.0軟件進行處理與分析,先對數(shù)據(jù)作單因素方差分析(One-way ANOVA),若組間有顯著差異,再進行 Duncan氏多重比較,P＜0.05表示差異顯著,P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 對蝦血細胞總數(shù)及血清中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 2可知,凡納濱對蝦血細胞總數(shù)隨飼料核苷酸混合物添加量的增加先增加后降低,其中 G0.4和 G0.6組極顯著高于對照組(P＜0.01),G0.8、G1.0和 G1.2組顯著高于對照組(P＜0.05)。飼料中添加核苷酸混合物可提高血清 SOD活性,其中G0.6和 G0.8組分別比對照組提高了 15.27%和16.07%,達到顯著水平(P＜0.05)。G0.4組血清T-AOC比對照組提高了 50.98%(P＞0.05),并顯著高于 G1.2組(P＜0.05),其他各組間無顯著差異(P＞0.05)。血清 POD和 AKP活性隨著核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趨勢,但各組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 對蝦肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性

由表 3可知,各組肝胰腺 SOD活性和 T-AOC先是隨飼料中核苷酸混合物添加量的增加而升高,均在 G0.4組達到最高值,而后隨著核苷酸混合物添加量的進一步增加,二者都呈現(xiàn)下降趨勢(P＜0.05),其中 G0～G0.6組 SOD活性顯著高于 G1.0組(P＜0.05),G0.1～G0.6組 T-AOC顯著高于G1.2組(P＜0.05),其他各組間無顯著差異(P＞0.05)。肝胰腺中 POD和 AKP活性隨著核苷酸混合物添加量的增加均呈先升高后降低的趨勢,但各組間未出現(xiàn)顯著差異(P＞0.05)。

2.3 對蝦肝胰腺和血清中 MDA含量及肌肉中抗活性

由表 4可知,凡納濱對蝦肝胰腺中 MDA含量隨著核苷酸混合物添加量的增加而降低,其中G0.2～G1.2組顯著低于對照組(P＜0.05);各添加組對蝦血清中 MDA含量與對照組相比呈現(xiàn)降低的趨勢,但差異不顯著(P＞0.05)。G0.2～G0.6組肌肉中抗 O-2?活性顯著高于 G1.0和 G1.2組(P＜0.05),其他各組間差異不顯著(P＞0.05)。

表2 核苷酸混合物對凡納濱對蝦幼蝦血細胞總數(shù)及血清中T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影響Table 2 Effects of nucleotide mixture on total haemocytes count,serum T-AOC,and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表3 核苷酸混合物對凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺中 T-AOC和 SOD、POD、AKP活性的影響Table 3 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas T-AOC and activities of SOD,POD and AKP of juvenile Litopenaeus vannamei

表4 核苷酸對凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺和血清中MDA含量及肌肉中抗 O2-?活性的影響Table 4 Effects of nucleotide mixture on hepatopancreas and serum MDA content and muscle anti-O2-?activity of juvenile Litopenaeus vannamei

3 討 論

甲殼動物缺乏像高等動物那樣的由免疫球蛋白介導的特異性免疫機能,其免疫主要為非特異性免疫。本試驗顯示,飼料中添加核苷酸混合物提高了凡納濱對蝦血細胞總數(shù)。血細胞在非特異性免疫反應中起著重要作用,血細胞總數(shù)的高低在一定程度上能體現(xiàn)機體抵抗病原體入侵能力的強弱[25]。Burrells等[26]用添加了核苷酸的鮭魚商品飼料(EWOSVEXTRA Alph,粒徑為 3 mm)飼喂感染鰻弧菌(Vibrio anguillarum)的虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、感染傳染性鮭魚貧血癥病毒(infectious salmon anaemia,ISA)和魚虱子(Lepeophtheirus salmois)的大西洋鮭魚(Salmo salar)、感染鮭立克次氏體屬(Piscirickettsia salmonis)微生物的銀大麻哈魚(Oncorhynchus kisutch),結(jié)果顯示,核苷酸能顯著降低虹鱒、大西洋鮭魚和銀大麻哈魚的死亡率;Leonardi等[27]在虹鱒體內(nèi)注射胰腺壞死病毒后飼養(yǎng)60 d,發(fā)現(xiàn)未添加核苷酸組的魚全部死亡,而添加核苷酸組的魚全都存活。這可能是由于血淋巴細胞補救合成嘧啶核苷酸的能力有限,而迅速分化的淋巴細胞對嘧啶核苷酸需要量又很大,因此飼料中補充外源核苷酸可以促使血細胞總數(shù)增加[28],從而提高免疫力。

本試驗結(jié)果表明,凡納濱對蝦幼蝦血清中 SOD活性隨核苷酸混合物添加量的升高而提高,飼料中添加一定量的核苷酸混合物能夠提高血清和肝胰腺中 T-AOC以及肝胰腺中 SOD活性,但核苷酸混合物添加量過高(1.0和 1.2 g/kg)時,SOD活性和T-AOC有下降趨勢;外源核苷酸對血清和肝胰腺中的 POD和 AKP活性的影響不顯著。這與在凡納濱對蝦[29]、鯉魚 (Cyprinus carpio)[30]及異育銀鯽(Carassiusauratus gibelio)[31]中的研究結(jié)果一致。這表明外源核苷酸可以提高凡納濱對蝦部分免疫因子的活性,但過度添加核苷酸并不能強化已處于正常狀態(tài)下的免疫系統(tǒng)。外源核苷酸影響機體非特異性免疫功能的機理還不是很清楚。本試驗還發(fā)現(xiàn),外源核苷酸可以極顯著提高血細胞總數(shù),而有報道指出體液因子可在血細胞中合成并釋放,細胞反應又受體液因子的介導和影響[32],因此,本文作者認為,外源性核苷酸可能通過這二者的協(xié)同作用來提高對蝦機體的免疫力。外源核苷酸提高機體相關(guān)免疫因子活性的另一個可能的原因是促進免疫相關(guān)基因的表達。Low等[33]檢測了以核苷酸飼料飼喂 15周的大菱鲆(Scophthalmus maximus)的非特異免疫相關(guān)基因的表達量,發(fā)現(xiàn)脾臟和鰓中免疫球蛋白 M(IgM)和重組激活基因 -1(RAG-1)以及腎臟中白介素 -1β(IL-1β)的基因表達量顯著高于未添加組。關(guān)于外源性核苷酸對凡納濱對蝦非特異性免疫相關(guān)基因表達等分子生物學機制,尚值得深入分析。

MDA是脂質(zhì)過氧化典型的代表產(chǎn)物,它可以衡量機體的抗氧化狀態(tài),又能間接反映出細胞損傷程度。O-2?是多種自由基的派生源,可以經(jīng)過一系列反應生成其他自由基,不僅其衍生的自由基具有細胞毒性,O-2?本身也有毒害作用,會導致細胞DNA損壞,破壞機體功能[34]。O-2?會對機體產(chǎn)生損傷作用,但機體內(nèi)也存在著對抗自由基的酶系統(tǒng)。本試驗結(jié)果顯示,飼料中添加核苷酸混合物能顯著降低肝胰腺中 MDA含量,一定程度提高肌肉中抗?活性。這表明外源核苷酸有助于清除凡納濱對蝦組織中的自由基,阻止脂質(zhì)過氧化作用。各組織中 MDA的降低趨勢與抗 O-2?、SOD、POD活性和T-AOC的變化趨勢相反,可能是由于這幾種酶都可以催化?發(fā)生歧化反應從而將其消除,防止生物脂質(zhì)過氧化損傷。王寶杰等[35]研究發(fā)現(xiàn),SOD對血細胞吞噬過程中 O-2?的產(chǎn)生有抑制作用。另外有報道認為,核苷酸本身具有抗氧化的作用,其堿基的氮原子能夠捕獲亞油酸氧化過程中形成的自由基,并能螯合加速氧化的銅、鐵等離子,減少由脂質(zhì)過氧化引起的細胞膜及 DNA的損傷[19]。錢佳等[36]研究發(fā)現(xiàn),鳥苷酸二鈉(GMP?Na2)具有劑量依賴性的體外抗氧化和清除活性氧的能力,10 mmol/L GMP?Na2添加組的羥自由基清除能力高達 96.64%。關(guān)于外源核苷酸對水產(chǎn)動物組織中脂質(zhì)過氧化物含量的影響及核苷酸本身抗氧化作用的研究較少見報道,有關(guān)問題仍有待進一步的研究。

本試驗以組織脂質(zhì)過氧化物含量及抗 O-2?活性作為指標,并結(jié)合 SOD、POD活性和 T-AOC等,探討了外源性核苷酸對凡納濱對蝦抗氧化能力的影響,但關(guān)于其進一步的作用機理,尚有待于深入研究。根據(jù)凡納濱對蝦非特異性免疫相關(guān)指標血細胞總數(shù),血清和肝胰腺中 SOD活性、T-AOC及肌肉中抗 O-2?活性出現(xiàn)最大值的范圍及 MDA含量出現(xiàn)最小值的范圍綜合分析,建議飼料中核苷酸混合物的添加量為 0.4～0.6 g/kg。

4 結(jié) 論

①飼料中添加一定量的核苷酸混合物能顯著提高凡納濱對蝦幼蝦血細胞總數(shù)和血清中 SOD活性,對 T-AOC及 POD、AKP活性有提高的趨勢。

②飼料中添加一定量的核苷酸混合物可一定程度地提高凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺中 SOD、POD和AKP活性及 T-AOC。

③飼料中添加一定量的核苷酸混合物可顯著降低凡納濱對蝦幼蝦肝胰腺中 MDA含量,提高肌肉中抗 O-2?活性。

④綜合分析以上相關(guān)指標,建議凡納濱對蝦幼蝦飼料中核苷酸混合物的添加量為 0.4～0.6 g/kg。

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