人嗜堿性粒細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系KU812F檢測(cè)牛乳及其替代品致敏性方法的建立

叢艷君，任發(fā)政

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

人嗜堿性粒細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系KU812F檢測(cè)牛乳及其替代品致敏性方法的建立

叢艷君1，任發(fā)政2,*

(1.北京工商大學(xué)食品學(xué)院，食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京市食品風(fēng)味化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100048；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083)

比較牛乳及其替代品釋放組胺的能力，以建立體外細(xì)胞檢測(cè)牛乳及替代品疑似過(guò)敏原組分致敏性的檢測(cè)方法。以嗜堿性粒細(xì)胞KU812F為研究對(duì)象，通過(guò)牛乳過(guò)敏患者血清的孵育，使細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，再以牛乳及其替代品過(guò)敏原作為激發(fā)物，使細(xì)胞脫顆粒釋放組胺。結(jié)果表明：利用嗜堿性粒細(xì)胞KU812F檢測(cè)牛乳及替代制品組胺釋放量的方法具有較高的可靠性及重現(xiàn)性，細(xì)胞釋放組胺的量與過(guò)敏原的劑量相關(guān)，在一定的劑量范圍內(nèi)，組胺的釋放率與過(guò)敏原的劑量呈正比，組胺釋放率達(dá)到最大之后，組胺釋放率與劑量呈負(fù)相關(guān)。

KU812F；組胺；過(guò)敏反應(yīng)；牛乳粉

嗜堿性粒細(xì)胞在食物超敏反應(yīng)中起著初級(jí)效應(yīng)細(xì)胞的作用，過(guò)敏原初次進(jìn)入過(guò)敏體質(zhì)的機(jī)體，刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE抗體，IgE與嗜堿性粒細(xì)胞結(jié)合，形成致敏嗜堿性粒細(xì)胞，此時(shí)機(jī)體處于致敏狀態(tài)，相應(yīng)變應(yīng)原再次進(jìn)入處于致敏狀態(tài)的機(jī)體，通過(guò)與致敏嗜堿性粒細(xì)胞表面緊密相鄰的特異性IgE“橋聯(lián)”結(jié)合，使致敏的細(xì)胞脫顆粒，釋放組胺、白三烯、激肽和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子等一系列具有生物活性的介質(zhì)，介質(zhì)作用于效應(yīng)器官與組織，而產(chǎn)生一系列的臨床癥狀[1-2]。

組胺釋放是評(píng)價(jià)過(guò)敏原致敏性的常用指標(biāo)，常用的方法是從過(guò)敏患者或致敏動(dòng)物的周邊血液中提取嗜堿性粒細(xì)胞進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)，評(píng)價(jià)過(guò)敏原致敏性[3-5]，但是提取靶細(xì)胞的復(fù)雜工藝及細(xì)胞不能長(zhǎng)期保存的缺點(diǎn)限制了此種方法的長(zhǎng)期連續(xù)應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用株化的嗜堿性粒細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系建立體外檢測(cè)牛乳及替代品疑似過(guò)敏原組分致敏性的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)材料包括液態(tài)奶和嬰兒配方粉，液態(tài)奶有牛乳、山羊奶、驢奶和水牛奶，每種液態(tài)奶是50份奶樣的等體積混合物，巴氏殺菌奶由實(shí)驗(yàn)室自制(牛奶65℃加熱30min)，另外從全國(guó)收集母乳100份，混合備用，嬰兒配方粉包括伊利金冠、雀巢能恩、多美滋金盾，水解物配方粉和氨基酸配方粉由伊利集團(tuán)技術(shù)中心友情提供。

KU812F美國(guó)模式菌種收集中心(ATCC)、組胺定量檢測(cè)試劑盒(ELISA) 上海江萊生物科技有限公司；胎牛血清、細(xì)胞培養(yǎng)板、人IgE抗體 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

S21-1恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器廠；YCP-100 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 北京市英博聯(lián)科技發(fā)展有限公司；TDL-50B低速離心機(jī) 上海安亭儀器廠；XDS200-PH倒置相差顯微鏡 北京中顯恒業(yè)儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛奶過(guò)敏患者血清的篩選

牛奶過(guò)敏患者血清由北京大學(xué)第三醫(yī)院皮膚科友情提供，牛乳過(guò)敏患者篩選參照文獻(xiàn)[6-7]，收集的血清用于細(xì)胞的敏化。本研究將5份血清混合，混合血清特異性IgE含量為41.2kU/L。

1.3.2 KU812F嗜堿性粒細(xì)胞的復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)

根據(jù)KU812F說(shuō)明書(shū)提供的方法進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。37℃水浴復(fù)蘇細(xì)胞株，在超凈臺(tái)內(nèi)把盛有細(xì)胞株的凍存管從水浴中取出，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液擦拭凍存管管身，然后從凍存管中吸取0.5mL細(xì)胞液，緩慢添加以5mL/min的速度加入4.5mL RPMI-1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清、2mmol/L L-谷氨酸、10mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖溶液(HEPES)中，125×g離心5min，取細(xì)胞。

以培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，稀釋到2×105，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)基，以后一般每2d更換一次培養(yǎng)基。

取細(xì)胞密度不超過(guò)1×106/mL的細(xì)胞液，125×g離心5min，除去上清液，加入新的培養(yǎng)液，吹打成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)、分裝。

1.3.3 組胺釋放率的測(cè)定[8]

選用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL細(xì)胞懸液，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，用臺(tái)式液(137mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl、1.8mmol/L CaCl2、1.1mmol/L MgCl2、11.9mmol/L NaHCO3、0.4mmol/L NaH2PO4、5.6mmol/L葡萄糖組成的溶液，pH7.2)洗2次，加入25μg/mL的人的IgE抗體，以促進(jìn)細(xì)胞高親和力受體高效表達(dá)，然后加入牛乳過(guò)敏患者混合血清2mL，加入10μg/mL抗人IgE抗體，37℃孵育4h，然后4℃、300×g離心10min，測(cè)定上清組胺含量，所得結(jié)果作為陽(yáng)性對(duì)照。

取12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL細(xì)胞懸液，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，用臺(tái)式液洗2次，加入25μg/mL的人IgE抗體，以促進(jìn)細(xì)胞高親和力受體高效表達(dá)，然后加入待測(cè)樣品，待測(cè)過(guò)敏原樣品一般以1.0μg/mL為初始質(zhì)量濃度，以10倍梯度稀釋，再加入牛乳過(guò)敏患者血清，37℃孵育4h，然后立即4℃、300×g離心10min，測(cè)定待測(cè)樣品上清液組胺含量。以不加待測(cè)樣品作為陰性對(duì)照組。將細(xì)胞用超聲破碎后，測(cè)定總組胺含量。上清液和細(xì)胞內(nèi)外總組胺含量均用組胺定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.4 方法的重現(xiàn)性與精確度的驗(yàn)證

選用12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2mL細(xì)胞懸液，每孔1×106個(gè)細(xì)胞，用臺(tái)式液洗2次，加入25μg/mL的人IgE抗體，然后再加入10μg/mL抗人IgE抗體，加入牛乳過(guò)敏患者血清，37℃敏化4h，然后4℃、300×g離心10min，測(cè)定上清組胺含量。以不加抗人IgE抗體作為陰性對(duì)照組。將細(xì)胞用超聲破碎后，測(cè)定總組胺含量。上清液和細(xì)胞內(nèi)外總組胺含量均用人組胺定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。其中抗人IgE標(biāo)準(zhǔn)品配成5種不同的稀釋質(zhì)量濃度——0.001、0.01、0.1、1、10μg/mL，每種質(zhì)量濃度均計(jì)算嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺率/%。以批內(nèi)誤差和批間誤差來(lái)表示該方法的精確度與可靠性。批內(nèi)誤差：抗人IgE質(zhì)量濃度作4次重復(fù)，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差，以其組內(nèi)變異系數(shù)表示批內(nèi)誤差；批間誤差：不同時(shí)間重復(fù)此實(shí)驗(yàn)，測(cè)定組胺釋放率，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，以組內(nèi)變異系數(shù)表示批間誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 精確度實(shí)驗(yàn)

表1 組胺釋放率的批內(nèi)精確度Table 1 Intra-plate accuracy of histamine release

由表1可知，變異系數(shù)最大值為0.075%、最小值為0.001%，批內(nèi)具有較好的精確性。比較3次測(cè)定的組胺釋放量的平均值，求出各質(zhì)量濃度的批間標(biāo)準(zhǔn)差，再計(jì)算出變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2，變異系數(shù)在0.001%～0.002%，批間同樣具有較好的精確性。鑒于批內(nèi)、批間數(shù)據(jù)的精確性，因此利用嗜堿性粒細(xì)胞KU812F檢測(cè)牛乳及替代制品組胺釋放量的數(shù)據(jù)具有較高的可靠性及重現(xiàn)性。

表2 組胺釋放率的批間精確度Table 2 Inter-plate accuracy of histamine release

2.2 KU812F測(cè)定牛乳及其替代品致敏性的應(yīng)用

圖1 KU812F檢測(cè)牛乳及替代品組胺釋放率Fig.1 Histamine release from KU812F basophils after sensitization with cow milk or its substitutes at different concentrations

如圖1所示，嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放率與過(guò)敏原的激發(fā)量密切相關(guān)，原料乳和巴氏殺菌奶在0.1μg/mL時(shí)組胺釋放率最大，全蛋白嬰兒配方粉在1μg/mL時(shí)組胺釋放率最大；不同乳及制品間，在同一劑量粗蛋白激發(fā)下，組胺釋放率均存在差異，如在0.1μg/mL條件下，牛奶作為細(xì)胞過(guò)敏原刺激物組胺釋放率最高，其次依次為水牛奶、羊奶、驢奶，4種全蛋白配方粉組胺釋放率也較低，差異顯著(P＜0.05)。氨基酸配方粉組胺釋放率高于全蛋白配方粉的組胺釋放率。

3 討 論

現(xiàn)有技術(shù)中用于檢測(cè)牛乳過(guò)敏原的方法有多種。其中，皮膚試驗(yàn)在臨床應(yīng)用極為普遍[9]，被認(rèn)為是過(guò)敏原評(píng)價(jià)的較為合理的方法，這種方法雖簡(jiǎn)便、快速，但其操作不安全、假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果出現(xiàn)率也很高。體外檢測(cè)技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)、放射過(guò)敏原吸附實(shí)驗(yàn)、高壓液相層析法等[10-12]，放射免疫法費(fèi)用昂貴且放射性同位素易污染環(huán)境，高效液相法儀器成本高、耗時(shí)費(fèi)力，酶聯(lián)免疫方法快速、方便，目前在過(guò)敏原檢測(cè)方面應(yīng)用比較多，但是這種方法主要對(duì)食品中致敏蛋白質(zhì)檢測(cè)比較準(zhǔn)確，如果產(chǎn)品中蛋白質(zhì)水解為多肽，由于包被洗滌過(guò)程中部分多肽的流失，ELISA方法就不準(zhǔn)確了。相對(duì)而言，組胺釋放試驗(yàn)更接近臨床試驗(yàn)，已作為皮膚試驗(yàn)的有效替代方法，在許多免疫學(xué)研究中得到比較廣泛的應(yīng)用[13-14]。

本研究以嗜堿性粒細(xì)胞KU812F為研究對(duì)象，通過(guò)牛乳過(guò)敏患者血清的孵育，使細(xì)胞處于致敏狀態(tài)，再加入牛乳及其替代品過(guò)敏原，使細(xì)胞脫顆粒釋放組胺，比較牛乳及其替代品釋放組胺的能力。Yamaguchi等[15]研究表明，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入IgE可以提高細(xì)胞高親和力受體表達(dá)水平，本研究在測(cè)定組胺釋放率實(shí)驗(yàn)中，為了提高組胺的釋放量，提高實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精確性，使用了人IgE抗體。Shim等[8]用人嗜堿性粒細(xì)胞腫瘤細(xì)胞系KU812和KU812F探索了體外檢測(cè)過(guò)敏原過(guò)敏性反應(yīng)的方法，發(fā)現(xiàn)KU812F傳代穩(wěn)定，分化能力強(qiáng)，易于培養(yǎng)，具有較高的FсεRI表達(dá)能力和組胺釋放能力。本實(shí)驗(yàn)在該研究基礎(chǔ)上優(yōu)化了細(xì)胞傳代培養(yǎng)的方法，驗(yàn)證了過(guò)敏原激發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺方法的可重復(fù)性和精確性，并成功應(yīng)用于乳及乳制品致敏性的檢測(cè)。嗜堿性粒細(xì)胞組胺釋放量與過(guò)敏原的激發(fā)量密切相關(guān)，原料乳和巴氏殺菌奶在0.1μg/mL組胺釋放率最大，全蛋白嬰兒配方粉在1μg/mL組胺釋放率最大，這種現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是由于不同樣品粗蛋白中過(guò)敏原含量差異所致；不同乳及制品間，在同一劑量粗蛋白激發(fā)下，組胺釋放率均存在差異，原因可能是在加工過(guò)程中乳蛋白與其他成分發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng)屏蔽了作用表位所致。

本研究初步探索了牛乳及制品體外激發(fā)嗜堿性粒細(xì)胞釋放組胺的規(guī)律，廣泛應(yīng)用于過(guò)敏原致敏性的篩選檢測(cè)有待于深入研究，要建立統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，包括明確血清孵育量、細(xì)胞株培養(yǎng)保存方法、過(guò)敏原激發(fā)量、組胺檢測(cè)方法等。

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Construction of an in vitro Allergy Reaction Evaluation Method for Cow Milk and Its Substitutes Using Human Leukemia Cell Line KU812F

CONG Yan-jun1，REN Fa-zheng2,*
(1. Beijing Key Laboratory of Food Flavor Chemistry, Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients, School of Food and Chemical Engineering, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China；2. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China)

This study aimed to construct an in vitro cellular assay for suspected allergenic components of cow milk and its substitutes using human leukemia cell line KU812F, an immature prebasophillic cell line based on their histamine release ability. KU812F was differentiated into basophils by incubation with serum from cow milk allergic people. The release of histamine from differentiated KU812F cells was monitored after sensitization with either cow milk or its substitutes. The results showed that this in vitro assay was highly reliable and reproducible in determining histamine release from KU812F cells after respective sensitization with cow milk and its products. Cow milk and its substitutes differed in their histamine release ability. Cow milk allergen induced histamine release in a dose-dependent manner. Specifically, a positive relationship was observed in a defined range of allergen dose, followed by a negative relationship after maximum histamine release.

KU812F；histamine；allergy；cow milk powder

TS207.3

A

1002-6630(2011)14-0202-04

2011-03-12

北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃面上項(xiàng)目(KM201110011003)

叢艷君(1978—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)楣δ苋橹破?。E-mail：congyj@th.btbu.edu.cn

*通信作者：任發(fā)政(1962—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)楣δ苋橹破?。E-mail：renfazheng@263.net