趙玉明 丁守強 （山東省青州市黃樓街道辦事處畜牧獸醫(yī)站 262518）

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奶牛乳腺炎診斷方法的研究進展

趙玉明 丁守強 （山東省青州市黃樓街道辦事處畜牧獸醫(yī)站 262518）

奶牛乳腺炎(mastitis)是指奶牛乳腺內(nèi)由病原微生物感染所引起的炎癥反應，是所有奶牛疾病中發(fā)病率最高，危害最為嚴重的一種疾病。根據(jù)是否出現(xiàn)臨床癥狀可將乳腺炎分為兩種類型：臨床型乳腺炎和隱性乳腺炎。前者具有明顯的臨床癥狀，容易被發(fā)現(xiàn)并及時治療，后者則因缺乏任何肉眼可見的臨床癥狀，診斷相對困難。目前診斷隱性奶牛乳腺炎的常用方法主要有牛奶體細胞計數(shù)(somatic cell counts, SCC)、美國加州乳腺炎診斷試驗(California mastitis test, CMT)及乳汁細菌分離鑒定，本文對這些診斷方法的優(yōu)缺點作一綜述。

1 體細胞計數(shù)法(SCC)

正常牛奶中的體細胞主要為巨噬細胞，約占體細胞總數(shù)的66%~88%，其余為中性粒細胞(約占1~11%)和上皮細胞等。乳腺感染時中性粒細胞數(shù)量急劇上升，導致牛奶中體細胞數(shù)量顯著升高[1]。因此，臨床上常以體細胞數(shù)量升高作為隱性乳腺炎的診斷指標之一。然而，國際上有關SCC的診斷標準至今仍未完全統(tǒng)一。傳統(tǒng)的觀念認為牛奶中SCC超過50萬個/ml即可診斷為隱性乳腺炎[2]，但也有人認為牛奶中SCC超過20萬個/ml[3]或10萬個/ml[4]便可診斷為隱性乳腺炎。

當前利用丹麥FOSS公司生產(chǎn)的體細胞計數(shù)儀進行牛奶中SCC測定是診斷隱性乳腺炎的常用方法。其基本原理是向牛奶中加入細胞溶解液使牛奶中體細胞破碎而分解出DNA，混入的熒光染料可與DNA結(jié)合。經(jīng)以上處理的牛奶樣品通過計數(shù)儀的毛細管時被儀器讀取相應信息而計算出SCC數(shù)值[5]。SCC與牛奶中多種指標存在緊密聯(lián)系，也可以作為其他方法診斷乳腺炎的參考[6]。雖然SCC法診斷乳腺炎具有快速方便的特點，但由金葡菌引起乳腺炎時SCC值卻通常小于20萬個/ml。這種情況在奶牛泌乳初期患乳腺炎時表現(xiàn)的尤為明顯[7]。另外，在奶牛分娩前后一段時間內(nèi)牛奶中體細胞數(shù)目會發(fā)生生理性的變化，分娩后SCC會急劇的上升，50d后又會降低到最小值，在泌乳后期又會緩慢的升高[8]，這些都可影響到SCC方法診斷乳腺炎的準確性。

2 細菌學鑒定

引起奶牛乳腺炎發(fā)生的微生物有細菌、病毒、支原體等多達130多種。其中主要病原微生物是金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、乳房鏈球菌等。通過培養(yǎng)乳汁進行微生物鑒定是診斷乳腺炎的常用方法。利用細菌鑒定診斷乳腺炎的方法不斷被完善，如揚州大學孫懷昌等研制出了選擇性鑒別不同病原菌的培養(yǎng)基[8]可以方便細菌培養(yǎng)鑒定。但細菌學診斷隱性乳腺炎仍然存在許多局限性。普通培養(yǎng)基對某些病原微生物，如支原體、病毒等無法培養(yǎng)鑒定。另外由于采集奶樣的牛場環(huán)境微生物豐富，不易保證采集的奶樣未受環(huán)境污染，故診斷隱性乳腺炎時容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果，而且細菌鑒定工作量大，至少需要2~3d才能做出鑒定結(jié)果。

3 奶樣電導率測定

奶牛發(fā)生乳腺炎時其奶樣中的Na+、K+含量上升，因此可以利用牛奶不同的電導率診斷乳腺炎[9,10]。牛奶pH的變化及乳脂含量的下降也可以影響電導率。已經(jīng)證實電導率與牛奶中SCC存在密切的關系[11]。對電導性能的測試信號可以轉(zhuǎn)變?yōu)橛嬎銠C信號，故而此法可以實現(xiàn)在線自動檢測。電導法檢測乳腺炎是目前為數(shù)不多的商業(yè)化的技術之一。我國已有西南民族學院86-I型隱性乳腺炎診斷儀、西北農(nóng)業(yè)大學XND-A型檢奶儀、山西農(nóng)業(yè)大學IRD型乳腺炎電子檢測儀。但乳腺炎并非是影響電導率的唯一因素，所以這是用電導法檢測乳腺炎的一個缺點。另外牛乳汁電導率數(shù)值有個體差異，約14%牛乳汁電導率高于正常值，約26%牛乳汁電導率低于正常值[12]，使該方法的應用受到了限制。

4 PCR診斷方法

Phuektes等[13]建立了一種以16s~23srDNA間隔區(qū)為擴增靶序列的多重PCR檢測方法。試驗測試了117份亞臨床感染的乳腺炎奶牛奶樣，結(jié)果均為陽性，同時證實金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌和乳房鏈球菌為主要的乳腺炎病原菌。Riffon等[14]也以16s~23srDNA間隔區(qū)為擴增靶序列建立了多重PCR檢測方法，檢測奶樣中引起奶牛乳腺炎的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌6種主要病原菌，結(jié)果均為陽性，試驗表明以16s~23srDNA間隔區(qū)為擴增靶序列建立的多重PCR檢測方法是一種快速敏感和特異的乳腺炎診斷方法。但該方法受技術操作的限制在基層推廣有較大的困難。

5 美國加州乳腺炎檢驗法(CMT)及其類似方法

該方法的基本原理是用一種陰離子表面活性物質(zhì)-烷基或烴基硫酸鹽，使乳汁中體細胞破裂，釋放出其中的核酸，CMT試劑與核酸物質(zhì)結(jié)合產(chǎn)生沉淀或凝膠，細胞中聚合的DNA是CMT產(chǎn)生陽性反應的主要成分，乳汁中體細胞數(shù)目越多，則釋放DNA越多，產(chǎn)生凝膠也就越多，凝集越緊密。根據(jù)這一原理我國蘭州(LMT)、北京(BMT)、杭州(HMT)等也研制出了診斷隱性乳腺炎的類似試劑。其它化學檢驗法還包括過氧化鈉法、苛性鈉凝乳試驗法、氯化鈣凝乳試驗及氯化物硝酸銀試驗等。

CMT及其類似劑檢測方法可以實現(xiàn)快速的牛旁檢測，操作方法簡便，適于在生產(chǎn)中推廣。但此方法的不足之處是有時遇到可疑病例的情況無法進行最終判定。

6 其他診斷方法

6.1 酶法 Ishikawa和Kitchen[15]研究證實，乳酸脫氫酶(LDH)主要來自被損害的上皮細胞和大量的乳汁白細胞，LDH活性增加反映了白細胞大量聚集的炎癥過程和乳腺組織的損害程度。黃利權等[16]研究發(fā)現(xiàn)，不同的乳腺炎病原微生物感染乳腺時呈現(xiàn)不同的酶象變化，與陰性感染的乳腺相比，LDH、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)等活性均增強。在金黃色葡萄球菌感染時，LDH的活性最高，并且認為LDH在隱性乳腺炎病程中起重要作用。

N-乙酰-β-D氨基葡萄糖苷酶(NAGase)也可以反映乳腺炎發(fā)生情況[17]。NAGase是一種細胞內(nèi)溶酶體酶，炎癥發(fā)生時由白細胞釋放進入奶樣。有研究表明，NAGase活性與SCC存在密切的關系，可以精確的反映炎癥水平。以NAGase作為參照物進行診斷乳腺炎具有很大的應用前景，目前已有電化學的方法對其進行研究[18]。其他報道的可以作為診斷乳腺炎標志物的酶還有葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase)、過氧化氫酶(CAT)、纖溶酶(Plasmin)等。纖溶酶原在炎癥發(fā)生時可從血液進入牛奶并轉(zhuǎn)化成纖維蛋白溶酶。后者已經(jīng)確定與SCC存在聯(lián)系，但其含量受牛體生理因素和環(huán)境因素的影響[19]。趙興緒等[20]的研究表明，LDH和NAG在不同類型的乳腺炎中，其活性差異都極顯著，在分析中表現(xiàn)出了較高的診斷價值。

6.2 急性時相蛋白(APP) 目前研究較多的APP是結(jié)合珠蛋白(Hp)和淀粉樣蛋白A(SAA)[21]。兩者在機體急性炎癥發(fā)生的時候含量可以上升100倍。Hp是牛的一種主要APP，該物質(zhì)主要在肝細胞中合成，在不同炎癥因子的刺激下合成增加。在正常情況下，牛奶中Hp含量極低以致無法檢出，而在乳腺炎癥發(fā)生過程中，由于血-乳屏障通透性升高，肝臟合成的Hp可通過血-乳屏障而從血液進入到牛奶中。因此，牛奶中Hp含量升高被認為是發(fā)生奶牛隱性乳腺炎的特異性標志[22,23]。并且目前已經(jīng)有針對Hp的光學免疫傳感器研制成功[24]。

SAA是一種載脂蛋白，且與奶樣中SCC存在密切的聯(lián)系。有研究表明其可以作為一種診斷乳腺炎的標志物[25]。但Ulrika Gr?nlunda的研究表明在奶牛牛奶中檢測Hp比檢測SAA更為容易[26]。

7 結(jié)語

奶牛乳腺炎作為奶牛養(yǎng)殖業(yè)中的常發(fā)病、多發(fā)病，每年造成巨大的經(jīng)濟損失。奶牛乳腺炎的發(fā)生對牛奶的質(zhì)量也產(chǎn)生很大影響，病原奶流入市場容易造成公共衛(wèi)生事件。所以對奶牛乳腺炎的科學防治一直是奶牛場非常重視的一項工作。

目前SCC法、CMT及類方法、病原菌鑒定法是生產(chǎn)中診斷奶牛隱性乳腺炎的主要方法。其中SCC方法需要購買體細胞計數(shù)儀，成本較高；CMT及類方法檢測成本低、檢測速度快，但不能對可疑病例做出準確的診斷；病原菌鑒定法對了解牛場的病原種類、科學防控具有重要意義，但檢測周期需2~3d，耗費較大人力物力。PCR方法也是診斷奶牛隱性乳腺炎的一種較可靠的方法。但PCR方法主要停留在實驗室診斷中，在生產(chǎn)中用PCR診斷需要一定的專業(yè)技術及相關設備，限制了其推廣普及。其他的診斷奶牛隱性乳腺炎的方法還有電導率、pH方法，但二者缺乏診斷準確性。另外根據(jù)牛奶中相關的酶、APP等在乳腺炎發(fā)生時濃度會有所變化，將這些酶或APP作為乳腺炎發(fā)生的標志物，進行乳腺炎的診斷亦有很大應用前景。

各種診斷奶牛隱性乳腺炎方法均有不同的側(cè)重點，還沒有一種絕對準確的方法。只有結(jié)合幾種診斷方法并根據(jù)奶牛不同的生理狀況才能科學診斷乳腺炎。建立診斷成本低、診斷速度快的奶牛隱性乳腺炎確診方法是一個重要的發(fā)展方向。

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（2011–05–16）

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